转染人凝血因子Ⅸ cDNA的血友病B患者皮肤成纤维细胞在小鼠体内的高效表达

本文报道了一个带有增强子的人巨细胞病毒(hCMV)启动子和人凝血因子ⅨcDNA的双拷贝反转录病毒载体(double-copy retroviral vector)-N2CMVIX的构建,转染PA317包装细胞后再离体感染血友病B患者皮肤成纤维细胞,可产生具有凝血活性的Ⅸ因子蛋白高达3420 ng/10~6细胞/24 h。将这些转染人Ⅸ因子cDNA的成纤维细胞包埋于胶原,植入小鼠皮下或腹腔内,人凝血因子Ⅸ蛋白表达最高值达105 ng/ml血浆,可在小鼠体内持续表达12天,其中90％以上的Ⅸ因子具有凝血话性,为血友病B基因治疗临床试验提供了一条可行的技术路线。     

MDMV外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

报道了玉米矮花叶病毒(MDMV)全长外壳蛋白cDNA基因的克隆、序列分析和表达产物鉴定的结果。根据其cDNA序列推测的外壳蛋白氨基酸顺序全长共有313个氨基酸,分子量总和为35 400 D,与聚丙烯酰胺凝胶电泳估算的值36 000 D相近,克隆的病毒外壳蛋白基因cDNA 3′-末端非编码区含有256个碱基。将此外壳蛋白的基因插入pUC19的1acZ基因中,转入E.coli后诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈现一特异性的蛋白带,经Western吸印与抗MDMV的兔血清呈阳性反应,证实所克隆的cDNA基因为MDMV外壳蛋白基因,并且能够正确表达。     

带红系增强子的人βE-珠蛋白基因在转基因小鼠中的表达

本文以我国人中常见的异常血红蛋白E(HbE,β26Glu→Lys,G→A)的β珠蛋白基因为外源基因,用显微注射法制备了人βE-基因的转基因小鼠系。得到的一只整合有16拷贝5′HS2βE重组体的转基因小鼠具有典型的转基因小鼠特征。证实人βE-基因在转基因鼠中的高水平表达需有红系特异性增强子(5′HS2)的存在;说明5′HS2结构对异常珠蛋白基因(βE-)在转基因鼠中的表达也具有明显的增强作用。单一位点整合过多5′HS2βE拷贝平均表达水平(12.1％)明显低于较少拷贝整合的平均表达水平(79.7％),对其发生机制进行了讨论。βE-珠蛋白肽链在转基因鼠中可形成新的血红蛋白四聚体。     

带有人凝血因子Ⅸ cDNA的反转录病毒载体的构建及其在离体细胞中的高效表达

报道了带有人凝血因子IX cDNA的高滴度高表达安全性反转录病毒载体的构建。采用LNL6反转录病毒载体为骨架,构建了由人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动的反转录病毒载体LNCIX,由反转录病毒LTR启动子驱动的反转录病毒载体LIXSN,以及由LTR和CMV启动子共同控制转录的反转录病毒载体LCIXSN,分别用电穿孔方法转导PA317辅助细胞株。LNCIX和LIXSN反转录病毒载体能在离体细胞中表达人IX因子蛋白,而LC'IXSN反转录病毒载体转移到离体细胞中没有检测到人IX因子蛋白。PA317/INCIX细胞的产病毒滴度为8×10~5CFU/ml,该重组病毒感染人纤维肉瘤细胞HT1080及血友病B患者皮肤成纤维细胞(HSF),用ELISA方法分别测定这些细胞的IX因子蛋白产量,LNCIX载体在HT-1080细胞中的人IX因子平均表达量为3.3μg/10~6细胞·d~(-1);在HSF细胞中的平均表达量为2.5μg/10~6细胞·d~(-1),其中80％以上的IX因子具有凝血活性,与过去相比,提高了产病毒滴度,增加了人IX因子的平均表达量,病毒载体骨架的设计更完善,降低了产生野生型病毒的概率,提高了安全性,对于进一步开展血友病B的基因治疗具有重要的意义。     

人肿瘤坏死因子(TNF)cDNA的分离、鉴定及其表达

PMA诱导的HL-60细胞株mRNA经逆转录合成cDNA;经过第一链cDNA为模板的PCR扩增反应,分离到一特异的615bp DNA片段。Southern杂交和DNA序列分析证实这一615bp片段包含了编码人TNF成熟肽所需的全部cDNA顺序。将这一人TNF cDNA克隆到大肠杆菌表达载体pKK223-3,获得人TNF直接表达质粒pHT-1。IPTG诱导的表达产物具有L-929细胞毒活性;并经抗体中和实验确证为人TNF。在A_(600)=2时,大肠杆菌产生的重组人TNF含量约为8×10~7U/1培养液。     

转基因鱼模型的建立

本研究运用显微注射方法,把带有小鼠重金属螯合蛋白(MT-1)基因启动顺序与人生长激素基因顺序的重组DNA片段,注入鲤鱼、鲫鱼和泥鳅等的受精卵内,在由此发育的受体中,50％以上整合了外源基因,成为转基因鱼。其中约有一半左右的转基因个体具有表达外源基因、合成人生长激素的能力,并显示出不同程度的快速生长效应。转基因鱼已通过有性生殖将外源基因传递给子代,后者亦具有表达人生长激素的能力。至此,本研究首次建立了一个高效、简洁而且完整的转基因鱼模型,它为鱼类基因工程定向育种新技术奠定了实验基础。同时,本文还就鱼类基因转移和育种的一系列理论问题进行了深入讨论。     

淇河鲫生长激素(growth hormone)全长cDNA的克隆与序列分析

用RT-PCR法和3′、5′RACE(Rapid amplification of cDNAends)法从淇河鲫脑垂体RNA克隆出生长激素(Growth hormone,GH)cDNA.此cDNA全长1191 nt(含Poly(A)14 nt),其5′端非编码区长55 nt、阅读框(Open readingframe,OAF)长633 nt,3′端非编码区长503 nt.其推导的GH由210个氨基酸组成,其中氮端前22个氨基酸为信号肽部分.氨基酸序列比较表明:淇河鲫与同目的鲫鱼、鲤鱼、团头鲂和斑马鱼的同源性分别为98.6%,96.2%,91.5%和88.6%;与不同目鱼的胡子鲇和鳗鲡的同源性分别为74.6%和49.5%;与哺乳类的家鼠和人等的同源性低于40%.     

hG-CSF cDNA 5′端序列修饰对其在原核细胞中表达的影响

本文设计并构建了人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)三种cDNA突变体表达质粒,对影响hG-CSF cDNA在大肠杆菌中表达效率的因素进行了探讨。指出cDNA 5′端起始密码子ATG的上、下游序列对其表达有显著影响。不同因素影响hG-CSF cDNA在大肠杆菌中表达效率的主要调控环节在转录水平;翻译水平的差别亦可能与其表达效率的不同有一定关系。     

人组织型纤溶酶原激活剂表达调控及高效表达的研究——Ⅰ.t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调控

运用分子剪切技术构建了含不同长度3′端非翻译区(3′-UTR)的t-PAcDNA克隆,体外转录的mRNA在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达的结果表明t-PA mRNA 3′-UTR序列对其表达有明显抑制作用,3′-UTR缺失使t-PA表达水平提高3—8倍。进一步研究表明,t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的抑制是由3′末端长约200nt的富含AU序列所致。RNA稳定性试验证实这段富含AU的序列使t-PA mRNA稳定性下降3倍以上;将该序列插入荧光素酶(Luc)基因3′-UTR,使Luc的表达水平明显降低。分析了该序列调节t-PA表达的可能机理,提出了调控的模式。     

α-因子指导下β-hCG在酵母中的合成和分泌

本文利用酵母接合因子α基因(MFα-1)的启动子、前导肽顺序(α-factor leader sequence)以及2μm质粒复制起始顺序(2μori)构建了一组酵母-大肠杆菌穿梭分泌型表达载体(pYNA,pYNB)。将人绒毛膜促性腺激素β-亚单位(β-hCG)基因(145肽顺序)融合于这一前导肽顺序的3′端,在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中得到表达和产物分泌。表达产物与天然β-hCG全抗体及单克隆抗体都有免疫反应。用β-hCG放射免疫双抗试剂盒测到每升培养物含有45μg产物。对这一产物的部分特性做了初步鉴定。     

大豆花叶病毒NIb基因的cDNA克隆和序列分析

以大豆花叶病毒北京分离株(SMV-BJ)RNA为模板,随机六聚核苷酸为引物,合成cDNA。根据SMV-BJ外壳蛋白基因序列和国外已报道的SMV,WMV-Ⅱ的有关序列,设计寡聚核苷酸引物。通过聚合酶连锁反应,得到了SMV NIb基因的全长cDNA克隆,并测定了其全序列。所测SMV NIb基因序列与WMV-Ⅱ(USA)株系比较,其核苷酸同源性达80.3％,由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性达到91.3％。综合SMV-BJ基因组3′端非编码区、外壳蛋白基因和NIb基因的资料,我们认为:WMV-Ⅱ可能是SMV的一个西瓜株系。实验中发现一些含NIb基因的重组克隆在3′端区域有大的序列变异,并讨论了这种变异的原因。在完成基因拚接、改造的基础上,构建了SMV-BJ NIb基因的高等植物表达载体。     

马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。     

带有人Ⅸ因子cDNA的反转录病毒载体的构建及其在血友病B患者皮肤成纤维细胞中的高效转移和表达

本文报道对血友病B实施基因治疗的可能性,首先将由SV40早期启动子,小鼠MT-1启动子和反转录病毒LTR启动子控制的Ⅸ因子cDNA构建到反转录病毒载体,然后用电穿孔法将构建的4个反转录病毒载体分别转入一株Amphotropic辅助细胞,PA317细胞,再用一株人纤维肉瘤细胞,HT1080细胞,测定这些辅助细胞的产病毒滴度,可得到2×10~4CFU/ml到5×10~5CFU/ml左右的病毒感染颗粒,用ELISA分别测定转有不同病毒载体的PA317细胞的Ⅸ因子蛋白产量,发现LTR启动子的表达效率最高,Ⅸ因子蛋白的分泌速率可达584ng/10~6细胞/24h,而SV40早期启动子和MT-1启动子的表达效率分别只有它的1/10和1/20,将表达效率最高的反转录病毒载体pXL—Ⅸ 1转入一株取自血友病B患者原代培养的皮肤成纤维细胞后同样能产生较高浓度的Ⅸ因子蛋白,其分泌速率可达549ng/10~6细胞/24h,其中75％以上的Ⅸ因子具有凝血活性,从而达到了首先在体外培养细胞纠正Ⅸ因子基因缺陷的目的,实现了血友病B基因治疗的第一步。     

人凝血因子Ⅸ在家兔体内的持续表达

本文报道用构建有人凝血因子Ⅸ cDNA的重组质粒(pCMV Ⅸ)或重组反转录病毒(XLⅨ和N2CMVⅨ)转染家兔原代培养的皮肤成纤维细胞(RSF),经过选择后将转有人Ⅸ因子cDNA的细胞包埋于胶原基质,然后进行自体或同种异体移植。腹腔移植有RSF-XLⅨ转化细胞的家兔血浆中人Ⅸ因子表达水平可达100ng/ml,表达持续5个半月;腹腔移植有RSF-pCMVⅨ细胞的家兔血浆中人Ⅸ因子水平可高达2.95ng/ml,表达至今已超过10个月,而且仍在继续检测中。在移植方法上,我们做了进一步改进,将收缩后的细胞胶原块移植改为细胞胶原液注射,使移植方法更简便有效,无需进行手术,用此法皮下移植有RSF-N2CMVⅨ转化细胞的家兔血浆中,人Ⅸ因子表达水平可高达480ng/ml,表达至今已有3个多月,其持续表达的趋势仍很乐观,为基因治疗的临床试验提供了一条更加切实可行的技术路线。     

小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

目的:制备B7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用.方法:首先采用PCR技术分别从pMD19-T/小鼠B7-H3和pMD19-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因.通过重叠PER技术将2段基因连接成B7-H3-Fc,经EcoR I和Bgl Ⅱ双酶切后插入真核表达载体plRES2-EGFP构建成pIRES2-EG-FWB7-H3-Fc重组载体.脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选能稳定分泌表达小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞,并经Western blot鉴定.该转基因细胞无血清培养后,收集细胞上清、超滤浓缩后行经Protein G柱纯化,获得纯品B7-H3-Fc融合蛋白.通过CCK-8以及ELISA方法检测小鼠B7-H3-Fc融合蛋白对T细胞体外增殖及细胞因子分泌的影响.结果:成功地构建了能稳定表达B7-H3-Fc融合蛋白基因的CHO转基因细胞株,该融合蛋白能够剂量依赖性地促进T细胞体外增殖及IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌.结论:本研究提示B7-H3作为重要的共刺激分子,在调节T细胞免疫应答中发挥了正性共刺激作用.     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

顺式效应的起源: 双取代乙烯衍生物的密度泛函理论研究

一般情况下双取代乙烯衍生物的反式构象要比顺式构象稳定. 但是例外也存在, 例如1,2-二氟乙烯和1,2-二氯乙烯. 这种双取代乙烯衍生物顺式构象的超常稳定性被称之为顺式效应. 该效应的起源和本质目前仍没有定论. 本文以12 个体系(XHC=CHY (X, Y=F, Cl, Br, CN, CH₃, C₂H₆, OCH₃))为例, 对顺式效应的有效性、起源和本质进行系统的密度泛函理论研究, 其中9个体系存在顺式效应, 另外3个为正常体系没有该效应. 采用一系列泛函和基组研究其有效性, 并运用四种分析手段, 如自然键轨道(NBO)、能量分量分析(EDA)、密度泛函活性理论(DFRT)和非共价相互作用(NCI)分析, 剖析该效应的起源和本质. 发现在顺式构象的两个取代基之间存在一种微弱的非共价相互吸引作用. 能量分析表明, 静电效应、立体效应等对顺式效应的存在都起着重要作用, 但是它们均不能单独用来解释顺式效应的起源. 也就是说顺式效应没有一个简单的起源, 它是多种作用合力的结果. 本文采用双变量解释得到比较合理的相关回归系数R²=0.86-0.87,较好地解释了顺式效应的本质和起源.     

成纤维细胞基因治疗血友病B的临床Ⅰ期试验

本文首次报道了以皮肤成纤维细胞为靶细胞,对血友病B患者实施基因治疗的监床Ⅰ期试验。首先用构建有人凝血因子Ⅸ cDNA的反转录病毒载体(XL-Ⅸ和N2 CMV-Ⅸ)感染血友病B患者皮肤成纤维细胞(HBSF),选择得到表达有人Ⅸ因子蛋白的细胞,而后进行一系列安全性检测,包括细胞连续传代形态观察;染色体分析,软琼脂试验;裸鼠接种试验;胶原过敏试验;内毒素试验等,在确定表达人Ⅸ因子蛋白的细胞的安全性后,大量扩增细胞,最后,细胞用胶原包埋,直接注射到血友病B患者腹部或背部皮下。患者1体内凝血因子IX浓度从71ng/ml上升到约240 ng/ml,至今维持在220ng/ml,持续表达6个月,凝血因子Ⅸ的凝血活性也从2.9％上升到6.3％,该患者的临床症状改善;患者2体内凝血因子Ⅸ浓度亦从130 ng/ml上升到约280 ng/ml,至今维持在220 ng/ml,持续表达5个多月,但活性增加不稳定。两名受试者至今没有发现任何副作用和危害,正在随访之中。我们认为反转录病毒介导的基因转移自体皮肤成纤维细胞,用胶原包埋,皮下移植是安全可靠的,也是简便易行的,从而成功地完成了血友病B基因治疗的临床Ⅰ期试验。     

半合成人肿瘤坏死因子cDNA的构建及其在大肠杆菌中的高表达

本文报道从人基因文库中分离淋巴毒素(LT)基因的同时,克隆了肿瘤坏死因子(TNF)基因,这两个基因相距1.2kb.TNF基因有4个外显子,第4外显子编码TNF成熟蛋白157个氨基酸中的140个.将第4外显子切出一部分,再人工合成编码其余氨基酸的DNA片段,两者连接构成重组的人TNF(rhTNF)cDNA,并克隆在大肠杆菌表达载体中成功地得到表达.5 l罐发酵得菌体约20g/l,以L929为靶细胞测定细胞毒活性为10~6-10~7单位/ml.高压液相色谱仪分离纯化rhTNF,冻干后得白色粉剂.测定了这种rhTNF的氨基端的10个氨基酸序列,证明与天然的人TNF完全相同.纯度约为95％.     

粘着斑激酶的原核表达、纯化及抗体的制备

粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是细胞质内单亚基非受体型酪氨酸激酶,通过各种信号途径参与调节细胞生长、发育、黏附、细胞骨架重组、转化、扩散和迁移等过程.采用PCR方法,从Flag-FAK质粒中克隆编码FAK C端273个氨基酸的基因片段,构建FAK融合蛋白原核表达载体pET28a( )/FAK,进行原核表达与蛋白纯化,取纯化的FAK蛋白免疫小鼠,制备FAK抗血清.结果表明构建的表达FAK C端功能结构域的原核表达质粒pET28a( )/FAK,经过BL21(DE3)大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,获得相对分子质量约33 kDa的融合蛋白,并利用小鼠制备了多克隆抗体,EL ISA检测显示该抗体有较高效价.荧光免疫结果显示此多克隆抗体与FAK蛋白特异性结合,为进一步研究神经细胞中FAK的作用机制奠定了基础.