水稻种子贮存蛋白Prolamin 4a基因的组织特异性表达调控

本文分离了水稻中花8号种子贮存蛋白Prolamin基因的5′端调控区域,对其DNA的全序列结构作了分析,表现启动子DNA的典型序列结构。构建了GUS融合基因,利用农杆菌LBA4404双元载体系统转化烟草,分子杂交获得转基因烟草植株,在转基因烟草开花20天时,对烟草种子作GUS基因表达的组织化学分析。实验结果表明Prolamin基因的启动子在种子的胚乳中激活下游GUS基因的表达,这是水稻Prolamin基因5′端调控序列功能的首次报道。     

以β-半乳糖苷酶为标记选出高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的天坛株重组痘苗病毒

我们从天坛株痘苗病毒的基因组中,分离编码11K及25K蛋白的双向转录启动子,以胸苦激酶(TK)基因为旁侧序列,插入到质粒pAT153中,构建成可以同时表达两个外源基因的载体质粒,并将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因及大肠杆菌的β-半乳糖苦酶(LacZ)基因,插入该载体质粒,使它们分别在11K及25K启动子钠控制下,构建成共表达质粒。用钙沉淀法将此质粒DNA同天坛株痘苗病毒在细胞内进行同源重组,在含X-gal的培养基挑蓝色蚀斑,简便、准确地选出重组痘苗病毒。所选到的重组痘苗病毒高效表达了HBsAg。我们还把上述重组痘苗病毒接种动物,观察了它们的毒力及免疫原性。     

霍乱弧菌无毒肠毒素A~-B~+基因在大肠杆菌的表达

应用DNA体外重组技术,成功地将霍乱弧菌毒素(CT)基因,在大肠杆菌中改建成CTA~-B~+基因克隆。组构的pMM-CTB重组质粒,在大肠杆菌中能高表达CTB亚单位,并能分泌到细胞外。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及其植物表达载体的构建

从感病的萝卜叶片中得到芜菁花叶病毒(TuMV)的分离物,以oligo(dT)为引物,合成了其基因组RNA的互补DNA,并克隆到载体λ-ZAPⅡ中。通过单链cDNA探针杂交和DNA末端序列分析找出含有poly-A尾巴的阳性克隆。我们对一个含有1429个碱基插入片断的克隆进行了序列分析,根据芜菁花叶病毒外壳蛋白分子量的大小和马铃薯Y病毒组蛋白质加工位点氨基酸序列的保守性,确定了外壳蛋白基因的5′末端。利用PCR方法对其5′末端进行改造,加进起始密码ATG和两个限制性内切酶位点。通过基因重组操作,将该基因插入到双元载体pBI121的衍生物pBIN437中,得到芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体。     

具有原核基因启动子活性的家蚕核多角体病毒的DNA片段

本文利用大肠杆菌启动子克隆用质粒pHE5,克隆和分离了家蚕核多角体病毒基因组的8种HindⅢ酶解DNA片段和一种SalⅠ酶解DNA片段。我们发现它们都具有指导抗四环素基因表达的启动子活性。测定了含有这些DNA片段的重组质粒的菌株抗四环素能力。其中最高的可以抗四环素至每毫升约30μg。我们分析了一个DNA片段的部分核苷酸顺序。发现它具有与原核基因启动子极相似的顺序结构。     

家蚕和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒P10基因的研究

从AcMNPV基因组DNA中克隆筛选得到含P10基因的EcoR I-P片段,以此作为探针克隆得到BmNPV P10基因片段,测定了其全核苷酸序列。PCR点突变BmNPV P10基因启始密码子ATG区,ATG突变的同时形成一个Bgl Ⅱ酶切位点,突变后的启动子及其5′端作为5′端交换臂和AcMNPV的P10基因3′端作为3′端交换臂构建成一个非融合通用转移载体pBmAcPV1.该载体可以在Sf细胞中和野生型AcMNPV DNA共转染重组表达外源基因,也可以在Bm细胞中和野生型BmNPV DNA重组表达外源基因。CAT基因在BmNPV P10 ATG突变后的启动子的控制下在家蚕细胞中得到高效表达     

表达烟草花叶病毒外壳蛋白的转基因烟草及其对TMV的抗性

利用体外重组DNA技术构建携带烟草花叶病毒(TMV,国内流行的普通株)外壳蛋白基因(CP)的中间表达载体,通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒,重组TMV-CP基因被转移至烟草细胞,并获得大量再生的转基因烟草。工程烟草的基因组经Southern印迹法分析证明,CP基因在再生工程株染色体中有1—5个拷贝的插入。分子杂交分析确证TMV-CP基因在转基因株中获得正确表达,其mRNA和蛋白产物的丰度分别达0.005—0.01％及0.05—0.2％。攻毒实验表明90％以上的能表达TMV—CP基因的工程烟草能不同程度地抑制病毒的复制、扩散,并显著延缓,减轻系统病状的发生。有3株工程植株直至花期无病状表现,生长正常。这一抗性作用机制在于转化细胞中的外壳蛋白在病毒侵染早期有效地抑制了入侵病毒颗粒的脱壳,从而阻断病毒的复制。     

丝心蛋白基因分子克隆与表达的初步探讨

通过聚合酶链反应扩增丝心蛋白Ｃ亚基结构的基因，并将基克隆到融合蛋白表达载体ｐＲＩＴ２Ｔ质粒中得到ｐＲＩＴ２Ｔ－ＦＬ质粒，在大肠杆菌株Ｐ２３９２内进行表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹反应证明融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达。     

中国人ω1型干扰素基因的克隆、一级结构测定以及在大肠杆菌中的表达

采用聚合酶链反应(PCR)方法,从中国正常胎儿肝细胞染色体DNA中分离并克隆了人ω1型干扰素基因,测定了核苷酸全序列,表明原有争议的第88位密码子为GGA的核苷酸序列是正确的,因此该氨基酸为Gly。随后又利用PCR技术将所获的ω1型干扰素基因原始克隆改造成适于在大肠杆菌中表达非融合蛋白的结构形式,并以pBV220为载体在P_RP_L串联启动子控制下进行温控表达。表达产物的抗病毒活性达6.5×10~7单位/升菌液(O. D_600=0.75)。IFN-ω1不仅具有很高的抗病毒活性,同时在结构上与动物滋养层蛋白高度相似,而后者又是作为母体妊娠识别信号存在于多种动物体内的抗黄体退化蛋白,因此本文获得的这—ω1型干扰素基因及重组蛋白在理论和实际上都有进一步研究的价值。     

玉米醇溶蛋白基因Z_4在双子叶植物龙葵(Solanum nigrum)中的表达

本文将含有玉米醇溶蛋白基因Z_4的玉米基因组克隆插入Ti质粒pTiT_(37)的T-DNA区。用带有此质粒的根癌农杆菌感染龙葵,得到了能合成胭脂碱的转化愈伤组织和转化植株。DNA分子杂交和RNA点杂交表明,Z_4基因确实转化并整合进了龙葵的核基因组,并且被转录成mRNA。但在转化体中,没能检测出玉米醇溶蛋白。实验证明,单子叶植物基因的启动子能够在双子叶植物中发挥功能。文中讨论了Z_4基因在双子叶转化植物的种子中受发育调节的可能性。     

hKv4.3基因5′非翻译区序列S160功能分析

hKv4.3基因是形成瞬时外向钾电流Ito的主要分子基础,它在心脏和神经细胞中大量表达,但在其它组织中则未见大量表达.为了研究hKv4.3表达在基因水平的调节,将hKv4.3基因的5′非翻译区的一段序列( 2~ 160,称之为S160)克隆到报告质粒中,进行瞬时表达.发现S160对hKv4.3基因的启动子和SV40的启动子都有强烈的抑制作用,没有方向特异性,但却有位置特异性.经删除突变分析,在S160片段中发现了一个抑制元件S(GAGGGGTTAA),它位于hKv4.3基因中转录起始位点下游20~30bp处.在此基础上,用RT-PCR方法对mRNA进行定量分析,初步确认这个抑制元件对蛋白表达的抑制过程是在翻译水平上.     

hKv4.3基因5'非翻译区序列S160功能分析

hKv4.3基因是形成瞬时外向钾电流Ito的主要分子基础, 它在心脏和神经细胞中大量表达, 但在其它组织中则未见大量表达. 为了研究hKv4.3表达在基因水平的调节, 将hKv4.3基因的5'非翻译区的一段序列(+2~+160, 称之为S160)克隆到报告质粒中, 进行瞬时表达. 发现S160对hKv4.3基因的启动子和SV40的启动子都有强烈的抑制作用, 没有方向特异性, 但却有位置特异性. 经删除突变分析, 在S160片段中发现了一个抑制元件S(GAGGGGTTAA), 它位于hKv4.3基因中转录起始位点下游20-30 bp处. 在此基础上, 用RT-PCR方法对mRNA进行定量分析, 初步确认这个抑制元件对蛋白表达的抑制过程是在翻译水平上.     

我国人乳头瘤病毒6型新变种基因组克隆及L1晚期结构基因在大肠杆菌中表达

本文从一例中国妇女外阴尖锐湿疣组织标本中提取DNA,BamHI酶切,以pAT153为载体,成功地克隆了我国人乳头瘤病毒6型(HPV-6BV)基因组.经South-ern杂交,酶谱及部分DNA序列分析,发现该克隆的HPV6基因组有明显变异,可视为我国发现的第一个HPV6的新变种.本文进一步分离了HPV6BV的L1基因,以pUR288为载体,在大肠杆菌中表达了β-半乳糖苷酶/HPV6BVL1N融合蛋白.经免疫转印试验证明,它既能与β-半乳糖苷酶抗血清反应,又能与HPV抗体反应,具有融合前各自的抗体亲和活性.该蛋白可用作诊断试剂及流行病学研究.     

肠道病毒71型外壳蛋白VP2在Pichia.pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法,克隆肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)SHZH03株外壳蛋白VP2基因,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP2,经序列测定证实α-factor信号肽和VP2的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导筛选到高效表达VP2蛋白的工程菌株.用饱和硫酸铵法对重组蛋白VP2进行了较好的纯化.Western Blot分析表明,重组蛋白VP2具有较好的反应原性,从而为发展EV71快速、高效、廉价诊断试剂奠定了基础.     

马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。     

人α-干扰素cDNA在转化的烟草植株中表达

本试验成功地将人的α-干扰素cDNA导入烟草细胞中,并得到了产生活性干扰素的转化烟草植株。将人的α-干扰素的cDNA通过平头末端连接的方法插入到植物表达质粒pAP2034中的T-DNA转录子1的启动子及其转录子7的加尾信号间的BamHI位点,构建了重组质粒piG3031,将此重组质粒导入Ti质粒载体pGV3850的T区,利用农杆菌感染叶盘的方法转化普通烟草1551,得到了抗卡那霉素的转化植株。DNA的Southern杂交表明:人的α-干扰素基因随同T-DNA一起整合进了烟草基因组中,新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)的检测表明:转化植株之所以能抗卡那霉素是因为NPTⅡ酶基因表达的缘故。而干扰素的生物活性检测的结果说明转化植株能产生有活性的α-干扰素。     

hKv4.3基因5＇非翻译区序列S160功能分析

hKv4.3基因是形成瞬时外向钾电流Ito的主要分子基础,它在心脏和神经细胞中大量表达,但在其它组织中则未见大量表达。为了研究hKv4.3表达在基因水平的调节,将hKv4.3基因的5＇非翻译区的一段序列（＋2～＋160,称之为S160）克隆到报告质粒中,进行瞬时表达。发现S160对hKv4.3基因的启动子和SV40的启动子都有强烈的抑制作用,没有方向特异性,但却有位置特异性。经删除突变分析,在S160片段中发现了一个抑制元件S（GAGGGGTTAA）,它位于hKv4.3基因中转录起始位点下游20～30 bp处。在此基础上,用RT-PCR方法对mRNA进行定量分析,初步确认这个抑制元件对蛋白表达的抑制过程是在翻译水平上。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1在大肠杆菌中的表达

将扩增得到的肠道病毒71型外壳蛋白VP1基因克隆到测序载体pGEM-T,测序验证该序列为目的片段后,将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-5x-1中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE分析和Western blot验证。结果表明,在经IPTG诱导的BL21中检测到分子量与预期大小相符的大约60 kDa的融合蛋白。利用表达产物作为抗原,对EV71感染病人阳性血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的检测用抗原。     

aprE基因表达的分子生物学和微量热法分析

利用分子生物学方法(SDS-PAGE和酶活检测法)未检测到所克隆的aprE基因在大肠杆菌中的表达产物(碱性蛋白酶), 而微量热法检测结果发现: 重组菌株的生长代谢产热曲线之间存在明显的差异. 根据这些差异, 分析了该基因的上、下游调控序列对该基因在大肠杆菌中表达的重要作用, 从而进一步对该基因进行了亚克隆, 得到了生物学方法可检测到的表达产物. 由此推测, 微量热技术有可能为检测外源基因表达及其调控, 以及为指导进一步基因工程操作提供一种新的快速灵敏的技术和方法.     

小麦ACCase CT功能域基因在大肠杆菌中的表达及与除草剂的相互作用

以中国春小麦幼苗为材料,克隆构建了小麦质体乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的羧基转移酶(CT)重组质粒( RCP18-5),并实现了重组质粒在大肠杆菌中的可溶性高表达.对重组蛋白的性质研究表明,该蛋白具有较强的疏水性,稳定性不高.为改善这种状况,对CT功能域基因进行了截短和延长,同样于大肠杆菌中进行表达.结果表明,仅长...