粘着斑激酶的原核表达、纯化及抗体的制备

粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是细胞质内单亚基非受体型酪氨酸激酶,通过各种信号途径参与调节细胞生长、发育、黏附、细胞骨架重组、转化、扩散和迁移等过程.采用PCR方法,从Flag-FAK质粒中克隆编码FAK C端273个氨基酸的基因片段,构建FAK融合蛋白原核表达载体pET28a( )/FAK,进行原核表达与蛋白纯化,取纯化的FAK蛋白免疫小鼠,制备FAK抗血清.结果表明构建的表达FAK C端功能结构域的原核表达质粒pET28a( )/FAK,经过BL21(DE3)大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,获得相对分子质量约33 kDa的融合蛋白,并利用小鼠制备了多克隆抗体,EL ISA检测显示该抗体有较高效价.荧光免疫结果显示此多克隆抗体与FAK蛋白特异性结合,为进一步研究神经细胞中FAK的作用机制奠定了基础.     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外培养呈现成纤维细胞表型,用12μmol//L 5-氮胞苷(5-aza)诱导培养,一周后细胞变为细长形成杆状.两周后培养细胞与临近的细胞融合,三周后形成类肌管状结构.通过RT-PCR检测,5-氮胞苷诱导前,间充质干细胞表达α-actin,desmin和MEF-2D,5-aza诱导后表达β-MHC和GATA4.westem Blot分析结果表明α-actin在诱导前后都表达,而myosin则在诱导后才表达.免疫荧光标记α-actin和β-MHC,证实了上述结果,即在5-氮胞苷诱导前后细胞表达α-actin,诱导后myosin才在细胞质中表达,Myosin和β-MHC是心肌细胞特异表达的蛋白.上述结果表明骨髓间充质干细胞具有向新生心室肌分化的潜能,这些诱导分化的细胞为心肌梗塞移植治疗提供一种潜在的供体细胞.