成纤维细胞基因治疗血友病B的临床Ⅰ期试验

本文首次报道了以皮肤成纤维细胞为靶细胞,对血友病B患者实施基因治疗的监床Ⅰ期试验。首先用构建有人凝血因子Ⅸ cDNA的反转录病毒载体(XL-Ⅸ和N2 CMV-Ⅸ)感染血友病B患者皮肤成纤维细胞(HBSF),选择得到表达有人Ⅸ因子蛋白的细胞,而后进行一系列安全性检测,包括细胞连续传代形态观察;染色体分析,软琼脂试验;裸鼠接种试验;胶原过敏试验;内毒素试验等,在确定表达人Ⅸ因子蛋白的细胞的安全性后,大量扩增细胞,最后,细胞用胶原包埋,直接注射到血友病B患者腹部或背部皮下。患者1体内凝血因子IX浓度从71ng/ml上升到约240 ng/ml,至今维持在220ng/ml,持续表达6个月,凝血因子Ⅸ的凝血活性也从2.9％上升到6.3％,该患者的临床症状改善;患者2体内凝血因子Ⅸ浓度亦从130 ng/ml上升到约280 ng/ml,至今维持在220 ng/ml,持续表达5个多月,但活性增加不稳定。两名受试者至今没有发现任何副作用和危害,正在随访之中。我们认为反转录病毒介导的基因转移自体皮肤成纤维细胞,用胶原包埋,皮下移植是安全可靠的,也是简便易行的,从而成功地完成了血友病B基因治疗的临床Ⅰ期试验。     

带有人Ⅸ因子cDNA的反转录病毒载体的构建及其在血友病B患者皮肤成纤维细胞中的高效转移和表达

本文报道对血友病B实施基因治疗的可能性,首先将由SV40早期启动子,小鼠MT-1启动子和反转录病毒LTR启动子控制的Ⅸ因子cDNA构建到反转录病毒载体,然后用电穿孔法将构建的4个反转录病毒载体分别转入一株Amphotropic辅助细胞,PA317细胞,再用一株人纤维肉瘤细胞,HT1080细胞,测定这些辅助细胞的产病毒滴度,可得到2×10~4CFU/ml到5×10~5CFU/ml左右的病毒感染颗粒,用ELISA分别测定转有不同病毒载体的PA317细胞的Ⅸ因子蛋白产量,发现LTR启动子的表达效率最高,Ⅸ因子蛋白的分泌速率可达584ng/10~6细胞/24h,而SV40早期启动子和MT-1启动子的表达效率分别只有它的1/10和1/20,将表达效率最高的反转录病毒载体pXL—Ⅸ 1转入一株取自血友病B患者原代培养的皮肤成纤维细胞后同样能产生较高浓度的Ⅸ因子蛋白,其分泌速率可达549ng/10~6细胞/24h,其中75％以上的Ⅸ因子具有凝血活性,从而达到了首先在体外培养细胞纠正Ⅸ因子基因缺陷的目的,实现了血友病B基因治疗的第一步。     

人凝血因子Ⅸ在家兔体内的持续表达

本文报道用构建有人凝血因子Ⅸ cDNA的重组质粒(pCMV Ⅸ)或重组反转录病毒(XLⅨ和N2CMVⅨ)转染家兔原代培养的皮肤成纤维细胞(RSF),经过选择后将转有人Ⅸ因子cDNA的细胞包埋于胶原基质,然后进行自体或同种异体移植。腹腔移植有RSF-XLⅨ转化细胞的家兔血浆中人Ⅸ因子表达水平可达100ng/ml,表达持续5个半月;腹腔移植有RSF-pCMVⅨ细胞的家兔血浆中人Ⅸ因子水平可高达2.95ng/ml,表达至今已超过10个月,而且仍在继续检测中。在移植方法上,我们做了进一步改进,将收缩后的细胞胶原块移植改为细胞胶原液注射,使移植方法更简便有效,无需进行手术,用此法皮下移植有RSF-N2CMVⅨ转化细胞的家兔血浆中,人Ⅸ因子表达水平可高达480ng/ml,表达至今已有3个多月,其持续表达的趋势仍很乐观,为基因治疗的临床试验提供了一条更加切实可行的技术路线。     

带有人凝血因子Ⅸ cDNA的反转录病毒载体的构建及其在离体细胞中的高效表达

报道了带有人凝血因子IX cDNA的高滴度高表达安全性反转录病毒载体的构建。采用LNL6反转录病毒载体为骨架,构建了由人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动的反转录病毒载体LNCIX,由反转录病毒LTR启动子驱动的反转录病毒载体LIXSN,以及由LTR和CMV启动子共同控制转录的反转录病毒载体LCIXSN,分别用电穿孔方法转导PA317辅助细胞株。LNCIX和LIXSN反转录病毒载体能在离体细胞中表达人IX因子蛋白,而LC'IXSN反转录病毒载体转移到离体细胞中没有检测到人IX因子蛋白。PA317/INCIX细胞的产病毒滴度为8×10~5CFU/ml,该重组病毒感染人纤维肉瘤细胞HT1080及血友病B患者皮肤成纤维细胞(HSF),用ELISA方法分别测定这些细胞的IX因子蛋白产量,LNCIX载体在HT-1080细胞中的人IX因子平均表达量为3.3μg/10~6细胞·d~(-1);在HSF细胞中的平均表达量为2.5μg/10~6细胞·d~(-1),其中80％以上的IX因子具有凝血活性,与过去相比,提高了产病毒滴度,增加了人IX因子的平均表达量,病毒载体骨架的设计更完善,降低了产生野生型病毒的概率,提高了安全性,对于进一步开展血友病B的基因治疗具有重要的意义。     

人凝血Ⅸ因子cDNA在转基因小鼠内的表达调控

为了研究人凝血IX因子cDNA在转基因小鼠内的表达,特别是顺式调节顺序的存在位置,本文将3种具有不同结构的人凝血IX因子cDNA的重组基因导入离体培养细胞,发现外源的人IX因子cDNA都能表达人IX因子蛋白,进而将它们分别作成转基因小鼠,结果发现在转基因小鼠内都失去了表达特性。这些结果证实了在人凝血IX因子cDNA中存在着决定其在转基因小鼠内表达的顺式调节顺序,同时也排除了这种顺式调节顺序存在于3′端非编码顺序中的可能性。作者再结合一些相关研究的结果,认为其顺式调节顺序可能存在于5′端的非编码顺序中。     

小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

目的:制备B7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用.方法:首先采用PCR技术分别从pMD19-T/小鼠B7-H3和pMD19-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因.通过重叠PER技术将2段基因连接成B7-H3-Fc,经EcoR I和Bgl Ⅱ双酶切后插入真核表达载体plRES2-EGFP构建成pIRES2-EG-FWB7-H3-Fc重组载体.脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选能稳定分泌表达小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞,并经Western blot鉴定.该转基因细胞无血清培养后,收集细胞上清、超滤浓缩后行经Protein G柱纯化,获得纯品B7-H3-Fc融合蛋白.通过CCK-8以及ELISA方法检测小鼠B7-H3-Fc融合蛋白对T细胞体外增殖及细胞因子分泌的影响.结果:成功地构建了能稳定表达B7-H3-Fc融合蛋白基因的CHO转基因细胞株,该融合蛋白能够剂量依赖性地促进T细胞体外增殖及IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌.结论:本研究提示B7-H3作为重要的共刺激分子,在调节T细胞免疫应答中发挥了正性共刺激作用.     

具有抗癌基因活性的一个cDNA克隆

本文发现了一个对受v-Ki-Ras基因恶性转化的小鼠成纤维细胞株DT具有抗癌基因活性的cDNA克隆p14-6。该cDNA克隆系从用正常人cDNA库转染DT造成的回复突变细胞株R14中回收得到的。用p14-6再次转染DT细胞株时,可使约5—15％的DT细胞发生形态回复突变。p14-6所造成的形态回复细胞系RR经体内和体外的恶性检验,证明其确为恶性程度较DT有显著降低的回复突变系。从R14中回收的其它cDNA克隆均不能产生此种回复突变。分子杂交显示p14-6以线形多聚体整合入RR基因组;v-Ki-Ras基因结构无可检出的变化。这些事实提示cDNA克隆p14-6对DT细胞的抗癌基因作用可能是由其cDNA的表达所引起。 对部分DT细胞被p14-6质粒转染后恶性不变的可能原因进行了讨论。     

基于Tet-On 3G的IFITM3诱导表达MDCK细胞系的建立及功能分析

利用Tet-On 3G系统构建了含人IFITM3基因的真核表达质粒pTRE3G-IFITM3,并将其与调控质粒pLVX-Tet3G共转染犬肾细胞(MDCK),转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行筛选,用多西环素(Dox)对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分析、IFITM3~+细胞百分数及定位分析.用含萤光素酶(Luciferase)报告基因的禽流感病毒H5/H7蛋白或VSV G蛋白包裹的假型慢病毒颗粒进行感染实验,检测萤光素酶活性.结果表明,筛选获得了携带人IFITM3的MDCK诱导表达细胞系,且IFITM3表达量与Dox剂量和诱导时间相关;确定Dox工作浓度为2.5μg/mL,诱导12 h时IFITM3~+细胞数达75%以上,且IFITM3在晚期内体/溶酶体存在分布;假型病毒感染及萤光素酶活性分析表明,IFITM3可显著抑制禽流感病毒H5,H7和VSV G蛋白介导的病毒进入,为深入探究其具体的抑制机制奠定了基础.     

Stage Ⅰ Clinical Trial of Gene Therapy for Hemophilia B

This paper describes the first human gene therapy trial for hemophilia B. Retroviruses were used to introduce human factor Ⅸ into autologous, primary human skin fibroblasts from the patients. Recombinant retroviral vector containing human FIX cDNA driven by viral LTR promoter (XL-Ⅸ) and double-copy retroviral vector driven by human cytomegalovirus enhancer-promoter (N2CMV-Ⅸ)were constructed. After the safety assessment, including soft-agar test, cell morphology observation, analysis of endotoxin, chromosome karyotype, allergic reaction test, nude mice test, routine pathological test, electromicroscopic analysis, and virus detection by PCR, etc., the engineered cells were pooled and embedded in collagen mixture, autologously injected into the patients respectively. The concentration of human FIX protein of Patient 1 increased from 71 ng/ml to 220 ng/ml, witha maximum level of 245 ng/ml. The expression of FIX has lasted for 6 months at the time of writing. The clotting activity also increased from 2.9%     

基于电场调控的胆固醇基液晶薄膜对成纤维细胞生长分化的影响

通过外加电场对胆固醇-g-聚乳酸低聚物(Cholesteryl-oligo(L-lactic acid),CLA)薄膜的液晶有序性进行调节，并评价其对成纤维细胞黏附、增殖和分化的影响。采用差示扫描量热仪检测CLA聚合物液晶性；以外加直流电场调控薄膜液晶有序性，X射线衍射仪和偏光显微镜检测电场调控下CLA薄膜液晶有序性的改变；Cell Counting Kit-8试剂盒检测成纤维细胞在CLA薄膜上的黏附与增殖行为，免疫荧光染色法和蛋白免疫印迹法检测成纤维细胞表型转化特征蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin, α-SMA)表达水平。结果表明，CLA聚合物具有液晶性，外加电场可通过诱导CLA液晶分子的有序排列调控CLA薄膜液晶性，CLA薄膜液晶性增强有利于成纤维细胞的增殖与α-SMA蛋白表达。说明电场调控可在不改变CLA聚合物薄膜基质材料组成的前提下，通过增加薄膜的液晶有序性，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化。     

空间记忆相关蛋白的蛋白质组学研究

C57BL/6J小鼠在评价空间记忆的多T迷宫(MTM)和Barnes迷宫(BM)中表现不同,本研究拟寻找导致这种行为差异的海马蛋白.应用双向凝胶电泳结合质谱鉴定和数据库检索,分析比较经两种迷宫训练测试后小鼠海马蛋白水平的不同,发现经过BM和MTM训练的小鼠有29种蛋白表达存在明显差异.其中,在BM训练组中5种蛋白表达上调,而在MTM组中24种蛋白表达上调.与空间记忆相关的蛋白按功能可分为如下6类:(1)能量代谢相关蛋白;(2)细胞骨架相关蛋白;(3)分子伴侣;(4)神经发育相关蛋白;(5)转录因子和蛋白合成相关蛋白;(6)信号转导蛋白.本研究结果丰富了空间记忆的机制,对于神经科学的进一步发展具有启发意义.     

一种新型海洋胶原蛋白复合水凝胶的制备及评价

海星具有很强的再生能力，体壁中含有丰富的胶原蛋白(SSC)。以甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA)和甲基丙烯酸化胶原蛋白(SSCMA)为原料，复合海洋源小球藻生长因子(CGF),采用紫外光交联法制备复合水凝胶，并对复合水凝胶的力学性能、溶胀性、降解性能、微观结构进行分析，同时验证了复合水凝胶对细胞的毒性及增殖作用。通过扫描电镜观察到SSCMA/HAMA/CGF复合水凝胶具有明显的孔状结构，随着HAMA比例的增加，水凝胶的力学性能也得到了提高。当HAMA的添加量为60%时，复合水凝胶在24 h内的溶胀率最大，可达到其自身重量的5倍左右。经过30天，SSCMA/HAMA/CGF-75发生最大量的降解。SSCMA/HAMA/CGF复合水凝胶对小鼠表皮成纤维细胞(L929)无毒副作用，表现出良好的细胞相容性，且对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)具有明显的增殖作用，其中SSCMA/HAMA/CGF-60对细胞的增殖率最大，可达129.70%。     

重组质粒pIRES-EGFP-BCL 11B电转染幼稚T细胞的可视化研究

将BCL 11B基因插入pIRES-EGFP构建重组质粒真核表达载体pIRES-EGFP-BCL 11B,采用电转染法将重组质粒转入人幼稚T细胞,转染24 h后,用原子力显微镜(AFM)观察转染前后细胞的表面形态以及生物物理性质的变化.转染72 h后,用CCK-8试剂检测幼稚T细胞的增殖情况.分别对空转的幼稚T细胞组、空载体转染组(pIRES-EGFP naked plasmid)、重组载体转染组(pIRES-EGFP-BCL 11B recombinant vector)、无电转无质粒的幼稚T细胞组进行实验.结果表明,4组幼稚T细胞的体积、高度、半宽度、粗糙度、表面颗粒大小等参数发生了变化,细胞杨氏模量以及细胞硬度也呈现很大变化,CCK-8结果显示,重组质粒pIRES-EGFP-BCL 11B电转染人幼稚T细胞后影响细胞的增殖.     

人IL-16基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定人白细胞介素16(IL-16)的重组腺病毒pAd-IL-16表达载体,为进一步研究IL-16功能奠定基础.方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),组胺刺激后提取总RNA,RT-PCR扩增IL-16基因,将其克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAd-IL-16,转染 HEK 293T细胞包装病毒.荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,RT-PCR和Western blot分别分析细胞内IL-16 mRNA和蛋白质的表达.结果:经双酶切及基因鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见约400 by插人片段,测序结果和GenBank中的基因序列一致;重组病毒效价为2.8×10～8 pfu/mL;重组病毒感染后,HEK 293T细胞中IL-16mRNA和蛋白质均有表达.结论:成功构建IL-16重组腺病毒载体,并可在HEK 293T细胞中表达,为进一步研究IL-16的功能奠定了基础.     

原子转移自由基聚合(ATRP)阳离子化菊粉作为非病毒基因载体的研究

利用原子转移自由基聚合(ATRP)将聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯[P(DMAEMA)]偶联到菊粉多糖(Inulin)上,合成了新型基因载体PDIN.利用核磁共振仪、动态光散射分析仪、透射电子显微镜和凝胶电泳对PDIN及其与质粒pDNA的复合物进行了表征.凝胶阻滞实验结果表明,PDIN可以通过静电相互作用稳定结合pDNA.噻唑蓝(MTT)细胞毒性测试、溶血实验、绿色荧光蛋白表达质粒(pGFP)及β半乳糖苷酶表达质粒(pβgal)转染实验结果表明,PDIN对MCF-7,Hela,COS7和HepG2细胞的毒性较小;其溶血率低,具有良好的血液相容性;载体PDIN能有效将pGFP和pβgal带入COS7细胞并表达,在N/P为1时转染效率最高,其β半乳糖苷酶的酶活为(3.36±0.74)U/mg蛋白,比Lipo2000转染效率[(4.33±0.77)U/mg蛋白]略低.因此,所合成的载体PDIN是一种有潜在应用价值的非病毒基因载体.     

钙(Ⅱ)对尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ⅰ的抗凝血活性的影响

皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子Ⅰ(ACFⅠ)不具有酶的活性,通过与活化凝血因子X(FXa)结合成1l的复合物来延长凝血时间。用高效液相色谱分析方法,发现ACFⅠ与FXa的结合反应依赖于Ca     

PEI-g-MPEG/白细胞介素-10基因传递系统转染背根神经节细胞的体外性能研究

探索非病毒基因载体聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物(PEI-g-MPEG)介导白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)体外转染原代培养背根神经节细胞(dorsal root ganglion cells,DRGs)的效果.采用本实验室设计合成的PEI-g-MPEG,与同时携带增强型绿色荧光蛋白报告基因及IL-10基因的真核表达质粒DNA(pDC316-EGFP/IL-10)形成复合物,以脂质体(lipofectamine)复合体系Lipo/pDNA为对照,通过溴乙啶(ethidiumbromide,EB)排斥实验、凝胶阻滞电泳实验、粒径与电位的测定及扫描电镜等实验方法观察PEI-g-MPEG/pDNA的复合效果.并且检测了复合物对DRGs的毒性、转染效果及IL-10的蛋白表达情况.结果表明,PEI-g-MPEG在N/P(PEI-g-MPEG所含的氮原子和质粒DNA中磷原子的摩尔比)为5时可完全复合pDNA;随着N/P的增大,PEI-g-MPEG/pDNA复合物的粒径逐渐减小,而表面电位逐渐增大;在N/P为15时报告基因转染效果和IL-10蛋白表达情况较好,复合物的形貌呈大小均一的球形.PEI-g-MPEG/IL-10基因传递系统对于神经病理性疼痛的基因治疗具有潜在应用价值.     

HCV全基因组培养细胞的比较蛋白组学研究

利用比较蛋白质组技术研究了转染丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)全基因组的人肝癌细胞系Huh7细胞模型中蛋白质表达谱的变化, 建立了Huh7-HCV的双向凝胶电泳蛋白质表达图谱和数据库. 通过双向凝胶电泳分离和图像分析, 对表达差异2倍以上蛋白质点进行了胶内酶解和MALDI-TOF MS鉴定. 得到包括与细胞骨架蛋白、细胞周期、凋亡和信号转导等相关的14个蛋白质, 并且用Western blot验证了热休克蛋白70的蛋白质组研究结果. 利用HCV全基因组培养系统, 采用蛋白质组学技术, 为研究HCV病毒和宿主细胞相互作用提供了新的实验数据, 为深入研究HCV病毒复制和分子致病机理奠定了基础.     

多壁碳纳米管活化A549细胞核转录子-κB的机制

探讨多壁碳纳米管对人肺上皮细胞A549核转录因子-κB(NF-κB)活性的影响及其活化机制.不同浓度的多壁碳纳米管作用于A549细胞后,用活性氧(ROS)敏感探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯结合流式细胞仪检测细胞内氧化应激状态;用凝胶电泳迁移率改变这一分析技术检测A549细胞NF-κB DNA结合活性;用蛋白印迹检测A549细胞NF-κB p65蛋白和IκBα蛋白表达;用免疫荧光结合共聚焦显微镜观察A549细胞NF-κB p65蛋白的核转位情况.结果表明,多壁碳纳米管诱导A549细胞内ROS过量产生和NF-κB DNA结合活性;同时伴有p65蛋白核移位和IκBα蛋白胞浆降解.抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)可抑制多壁碳纳米管诱导的A549细胞内ROS产生、NF-κB DNA结合活性、p65蛋白核移位以及IκBα蛋白降解.结果表明,多壁碳纳米管可以通过诱导A549细胞氧化应激机制从而活化核转录因子NF-κB活性.     

人工细胞外基质对血管内皮细胞生存的影响

通过物理吸附方法, 利用胶原、 聚赖氨酸和融合蛋白VEGF-Fc对聚苯乙烯培养板表面进行改性, 以研究细胞外基质材料对血管内皮细胞的影响. 结果表明, 3种蛋白显著提高了聚苯乙烯表面的亲水性. 内皮细胞的黏附、 增殖、 细胞骨架蛋白染色和血管性血友病因子(vWF)免疫染色实验结果表明, 胶原、 聚赖氨酸和VEGF-Fc基质均能有效提高血管内皮细胞的黏附, 其中胶原可与VEGF协同作用促进内皮细胞分化表型的表达; VEGF-Fc基质兼具了VEGF的生物学活性, 可促进内皮细胞的黏附和增殖以及vWF功能性蛋白的表达. 本研究为诱导材料表面内皮化和血管新生的生物活性材料的设计开发提供了新思路.