转染人凝血因子Ⅸ cDNA的血友病B患者皮肤成纤维细胞在小鼠体内的高效表达

本文报道了一个带有增强子的人巨细胞病毒(hCMV)启动子和人凝血因子ⅨcDNA的双拷贝反转录病毒载体(double-copy retroviral vector)-N2CMVIX的构建,转染PA317包装细胞后再离体感染血友病B患者皮肤成纤维细胞,可产生具有凝血活性的Ⅸ因子蛋白高达3420 ng/10~6细胞/24 h。将这些转染人Ⅸ因子cDNA的成纤维细胞包埋于胶原,植入小鼠皮下或腹腔内,人凝血因子Ⅸ蛋白表达最高值达105 ng/ml血浆,可在小鼠体内持续表达12天,其中90％以上的Ⅸ因子具有凝血话性,为血友病B基因治疗临床试验提供了一条可行的技术路线。     

人凝血因子Ⅸ在家兔体内的持续表达

本文报道用构建有人凝血因子Ⅸ cDNA的重组质粒(pCMV Ⅸ)或重组反转录病毒(XLⅨ和N2CMVⅨ)转染家兔原代培养的皮肤成纤维细胞(RSF),经过选择后将转有人Ⅸ因子cDNA的细胞包埋于胶原基质,然后进行自体或同种异体移植。腹腔移植有RSF-XLⅨ转化细胞的家兔血浆中人Ⅸ因子表达水平可达100ng/ml,表达持续5个半月;腹腔移植有RSF-pCMVⅨ细胞的家兔血浆中人Ⅸ因子水平可高达2.95ng/ml,表达至今已超过10个月,而且仍在继续检测中。在移植方法上,我们做了进一步改进,将收缩后的细胞胶原块移植改为细胞胶原液注射,使移植方法更简便有效,无需进行手术,用此法皮下移植有RSF-N2CMVⅨ转化细胞的家兔血浆中,人Ⅸ因子表达水平可高达480ng/ml,表达至今已有3个多月,其持续表达的趋势仍很乐观,为基因治疗的临床试验提供了一条更加切实可行的技术路线。     

带有人Ⅸ因子cDNA的反转录病毒载体的构建及其在血友病B患者皮肤成纤维细胞中的高效转移和表达

本文报道对血友病B实施基因治疗的可能性,首先将由SV40早期启动子,小鼠MT-1启动子和反转录病毒LTR启动子控制的Ⅸ因子cDNA构建到反转录病毒载体,然后用电穿孔法将构建的4个反转录病毒载体分别转入一株Amphotropic辅助细胞,PA317细胞,再用一株人纤维肉瘤细胞,HT1080细胞,测定这些辅助细胞的产病毒滴度,可得到2×10~4CFU/ml到5×10~5CFU/ml左右的病毒感染颗粒,用ELISA分别测定转有不同病毒载体的PA317细胞的Ⅸ因子蛋白产量,发现LTR启动子的表达效率最高,Ⅸ因子蛋白的分泌速率可达584ng/10~6细胞/24h,而SV40早期启动子和MT-1启动子的表达效率分别只有它的1/10和1/20,将表达效率最高的反转录病毒载体pXL—Ⅸ 1转入一株取自血友病B患者原代培养的皮肤成纤维细胞后同样能产生较高浓度的Ⅸ因子蛋白,其分泌速率可达549ng/10~6细胞/24h,其中75％以上的Ⅸ因子具有凝血活性,从而达到了首先在体外培养细胞纠正Ⅸ因子基因缺陷的目的,实现了血友病B基因治疗的第一步。     

带有人凝血因子Ⅸ cDNA的反转录病毒载体的构建及其在离体细胞中的高效表达

报道了带有人凝血因子IX cDNA的高滴度高表达安全性反转录病毒载体的构建。采用LNL6反转录病毒载体为骨架,构建了由人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动的反转录病毒载体LNCIX,由反转录病毒LTR启动子驱动的反转录病毒载体LIXSN,以及由LTR和CMV启动子共同控制转录的反转录病毒载体LCIXSN,分别用电穿孔方法转导PA317辅助细胞株。LNCIX和LIXSN反转录病毒载体能在离体细胞中表达人IX因子蛋白,而LC'IXSN反转录病毒载体转移到离体细胞中没有检测到人IX因子蛋白。PA317/INCIX细胞的产病毒滴度为8×10~5CFU/ml,该重组病毒感染人纤维肉瘤细胞HT1080及血友病B患者皮肤成纤维细胞(HSF),用ELISA方法分别测定这些细胞的IX因子蛋白产量,LNCIX载体在HT-1080细胞中的人IX因子平均表达量为3.3μg/10~6细胞·d~(-1);在HSF细胞中的平均表达量为2.5μg/10~6细胞·d~(-1),其中80％以上的IX因子具有凝血活性,与过去相比,提高了产病毒滴度,增加了人IX因子的平均表达量,病毒载体骨架的设计更完善,降低了产生野生型病毒的概率,提高了安全性,对于进一步开展血友病B的基因治疗具有重要的意义。     

Stage Ⅰ Clinical Trial of Gene Therapy for Hemophilia B

This paper describes the first human gene therapy trial for hemophilia B. Retroviruses were used to introduce human factor Ⅸ into autologous, primary human skin fibroblasts from the patients. Recombinant retroviral vector containing human FIX cDNA driven by viral LTR promoter (XL-Ⅸ) and double-copy retroviral vector driven by human cytomegalovirus enhancer-promoter (N2CMV-Ⅸ)were constructed. After the safety assessment, including soft-agar test, cell morphology observation, analysis of endotoxin, chromosome karyotype, allergic reaction test, nude mice test, routine pathological test, electromicroscopic analysis, and virus detection by PCR, etc., the engineered cells were pooled and embedded in collagen mixture, autologously injected into the patients respectively. The concentration of human FIX protein of Patient 1 increased from 71 ng/ml to 220 ng/ml, witha maximum level of 245 ng/ml. The expression of FIX has lasted for 6 months at the time of writing. The clotting activity also increased from 2.9%     

Expression of Human Factor Ⅸ cDNA in Mice by Implants of Genetically Modified Skin Fibroblasts From a Hemophilia B Patient

Double-copy retroviral vector containing human factor Ⅸ cDNA driven by human cytomegalovirus enhancer-promoter was constructed. The vector was introduced into the amphotropic packaging cell line PA317. The recombinant virus produced in PA317 was used to transduce skin fibroblasts from a hemophilia B patient. The infected cells produced high levels of biologically active human factor Ⅸ at a rate of 3420 ng/10~6 cells/24 h. These cells were embedded in a collagen matrix and implanted into the peritoneal cavity or subcutaneous space of mice. It was demonstrated that human factor Ⅸ was produced by the implants for at least 12 days in vivo, reaching a peak of 105 ng/ml plasma. Over 90% of the protein was functionally active. This technique has the potential to be developed into a new approach for gene therapy for hemophilia B.     

HIGH EFFICIENT TRANSFER AND EXPRESSION OF HUMAN CLOTTING FACTOR Ⅸ cDNA IN CULTURED HUMAN PRIMARY SKIN FIBROBLASTS FROM HEMOPHILIA B PATIENT BY RETROVIRAL VECTORS

To study the possibility of somatic gene therapy for hemophilia B via gene transfer to primary factor Ⅸ-deficient skin fibroblasts, we constructed four retroviral vectors containing factor Ⅸ cDNA driven by retroviral LTR promoter, SV40 early promoter and mouse MT-I promoter, respectively. These retroviral vectors were transfected into an amphotropic packaging cell line, PA317 cells, by electroporation, and a human iibrosarcoma cell line, HT1080 cells, was used to assay the factor Ⅸ-virus titers of these four virus-producing PA317 cells, which ranged from 2×10~4 to 5×10~5 cfu/ml. The factor Ⅸ proteins produced by bulk population of four virus-producing PA317 cells were determined by ELISA. Results showed that LTR promoter directed the highest production of factor Ⅸ at the rate of 584 rig/10~6 cells/24h, while SV40 early promoter and MT promoter directed about 10 and 20 times less production of factor Ⅸ than LTR promoter. The highest expressed retroviral vector XL-Ⅸ was used to infect a line of f     

Long-Term Expression of Human Factor Ⅸ cDNA in Rabbits

In this study, rabbits were used as a model for gene therapy for hemophilia B, Human factor Ⅸ cDNA was transferred to cultured normal rabbit skin fibroblasts (RSF) by a recombinant plasmid (pCMVIX) or retrovirus(XL-IX or N2CMVIX) constructed in our laboratoy. Infected fibroblasts capable of synthesizing and secreting high levels of biologically active human factor Ⅸ protein were selected and embedded in a collagen matrix. The latter was surgically implanted into rabbits as autografts or allografts. Human factor Ⅸ protein was detected in the plasma of all the grafted rabbits, and its expression has been maintained for more than 10 months at the time of writing. In addition, we have improved and simplified the method of implantation from surgically grafting the tissue-like matrix to the injection of the infected cell-collagen mixture subcutaneously. Using the latter method, human factor Ⅸ in rabbits injected with RSF-N2CMVIX reached a peak of 480 ng/ml plasma, and its expression has continued for more     

胶原-磺化羧甲基壳聚糖/硅橡胶皮肤再生材料的制备及其对小型猪烫伤创面全层皮肤缺损的修复研究

制备了一种胶原-磺化羧甲基壳聚糖/硅橡胶皮肤再生材料,并以小型猪为模型,考察了其对烫伤全层皮肤缺损的修复性能.首先合成了磺化羧甲基壳聚糖,并对其结构进行了表征.制备了胶原-磺化羧甲基壳聚糖多孔支架,采用扫描电子显微镜(SEM)研究了磺化羧甲基壳聚糖含量对支架微结构的影响.随着磺化羧甲基壳聚糖含量的增大,胶原-磺化羧甲基壳聚糖支架从纤维结构向片状结构转化,且支架的孔径相对变大.采用体外成纤维细胞培养实验证明胶原-磺化羧甲基壳聚糖支架无明显细胞毒性.进一步将胶原-磺化羧甲基壳聚糖支架与硅橡胶膜复合,构建具有双层结构的皮肤再生材料.以小型猪为模型,评价了其对深度烫伤创面的修复性能.大体观察和组织学分析结果显示,胶原-磺化羧甲基壳聚糖/硅橡胶皮肤再生材料具有更快的血管化性能,且经该材料处理的创面能有效支持薄自体皮片的移植成活,实现深度烫伤创面的全层修复.     

纳米细菌纤维素膜的表征与生物相容性研究

利用木醋杆菌静态培养法制备的由纳米纤维组成的细菌纤维素膜具有超细的三维网络结构和适当的孔隙率. 利用光镜、扫描电镜和原子力显微镜对其进行结构表征发现, 细菌纤维素膜具有极为精细的纳米网络结构, 冻干膜的孔径约为0.6~2.8 μm; 纤维素带宽度约为50~80 nm. 采用湿重与浮重结合法测定烘干膜和冻干膜的孔隙率分别约为70%和90%. 由于细菌纤维素含有大量的羟基, 故烘干膜表现出极好的透湿性. 将细菌纤维素膜分别与成纤维细胞和软骨细胞进行复合培养, 并将成纤维细胞和细菌纤维素膜的复合物进行裸鼠皮下移植实验. 结果显示, 移植的复合物很好地融入了裸鼠正常皮肤, 成纤维细胞和软骨细胞在细菌纤维素表面形成连续的细胞层, 绿色荧光蛋白表达正常. 以上结果表明, 细菌纤维素膜非常适合细胞贴附和增殖, 表现出较好的生物相容性, 有望成为新型组织工程支架材料.     

p38 MAPK信号通路在人胚肺成纤维细胞表达I型胶原中的调控作用

目的:探讨P38MAPK信号通路在调控人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖和I型胶原表达中的作用.方法:收集矽肺患者肺泡巨噬细胞(AM),在体外用含有SiO_2的DMEM培养液和不含Si0_2:的DMEM培养液培养18 h,然后收集培养的AM上清液.用该上清培养HELF,WST-1法检测HELF增殖情况,用免疫细胞化学法检测HELF中I型胶原的表达.结果:经Si0_2刺激的矽肺患者AM培养上清可促进HELF增殖和I型胶原的表达(平均A值为0.304±0.032),与空白对照组(平均A值为0.153±0.021)、对照组(平均吸光度值为0.213±0.021)比较增加,差异有统计学意义(P<0.01);预处理组加入了10μmoI/Lp38 MAPK特异性抑制剂,SB203580后,HELF增殖能力和I型胶原的表达下降(平均A值为0.176±0.020),与处理组相比差异明显(P<0.01).     

气相色谱法测定化合物中R-氯甘油的含量

建立了气相色谱法测定化合物中R-氯甘油含量的方法.试验条件:FID检测器,检测器温度为290℃;进样口温度280℃,分流比1∶1;载体为氮气,流速5 m L/min;柱温初始温度75℃,保持3 min,以20℃/min的升温速率上升到150℃,再以8℃/min的升温速率上升到180℃,以30℃/min的升温速率上升到240℃,并维持12.5 min.试验结果:空白溶剂不干扰测定,R-氯甘油峰与其他残留溶剂峰分离度良好,检测限为2.06 ng,定量限为6.58 ng,方法专属、灵敏.在80～200μg/ml范围内,R-氯甘油浓度与峰面积的线性关系良好,线性方程为y=2.558 8x-62.469,线性回归系数r为0.999 4.同一溶液连续进样6次,结果之间的RSD低于1.0%,方法进样精密度良好.同一均质样品平行测定6份,结果之间的RSD低于1.5%,方法重复性良好.加样回收率结果均介于98%～102%之间,方法准确度良好.方法适用于胆碱类物质中R-氯甘油含量的测定.     

人嗜中性白细胞活化蛋白-1/白细胞介素-8基因的半化学半酶促合成及在大肠杆菌的表达

本文采用半化学半酶促法合成了人嗜中性白细胞活化蛋白-1/白细胞介素-8(NAP-1/IL-8)的全基因,并在大肠杆菌系统中利用P_RP_1串联启动子进行了温控型的高效表达,通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,在摇瓶培养的大肠杆菌中,NAP-1/IL-8的表达量可占菌体可溶性蛋白的18.5％,而在实验室规模的发酵试验中,其表达量则占可溶性蛋白的10.9％.经凝胶过滤层析和阳离子交换层析两个简单的纯化步骤,得到SDS-PAGE纯的重组NAP-1/IL-8,采用琼脂糖平板法进行测定,表明所得NAP-1/IL-8纯品在<10ng/ml的水平上显示出强烈的嗜中性白细胞趋化活性,家兔皮肤试验的结果显示,重组人NAP-1/IL-8可在家兔体内引起早发型超敏反应,采用Edman降解法测定重组人NAP-1/IL-8纯品N末端36个氨基酸的序列,与天然人NAP-1/IL-8的成熟分子完全符合。     

介孔硅酸镁改性硫酸钙骨水泥的降解及成骨性

将介孔硅酸镁(m-MS)掺杂到硫酸钙(CS)中,制备了一种新型复合骨水泥(m-MSC)。结果显示:掺入m-MS,延长了m-MSC的固化时间;提高了其降解速率;掺入m-MS可中和CS降解产生的酸性物质,缓解p H值下降。体外细胞实验显示:m-MSC能促进MC3T3-E1细胞增殖和分化;动物体内植入实验显示:m-MSC的成骨量和Ⅰ型胶原阳性表达率都显著高于CS。     

介孔硅酸镁改性硫酸钙骨水泥的降解及成骨性

将介孔硅酸镁(m-MS)掺杂到硫酸钙(CS)中,制备了一种新型复合骨水泥(m-MSC)。结果显示:掺入m-MS,延长了m-MSC的固化时间;提高了其降解速率;掺入m-MS可中和CS降解产生的酸性物质,缓解pH值下降。体外细胞实验显示:m-MSC能促进MC3T3-E1细胞增殖和分化;动物体内植入实验显示:m-MSC的成骨量和Ⅰ型胶原阳性表达率都显著高于CS。     

巯基乙酰萘胺极谱行为研究及分析应用 Ⅱ.银(Ⅰ)离子的示波极谱测定

在前文研究的基础上,经试验,证明Ag(Ⅰ)与巯萘剂(TN)反应生成非电活性物质,导致电活性物质DTN电流降低。在最佳条件下,Ag(Ⅰ)浓度在3.7×10~(-8)～4.5×10(-7)mol/L范围内与DTN电流峰高降低值成线性关系,检出限为2.2×10~(-8)mol/L(相当于2.4ng/ml)Ag(Ⅰ)。方法用于纯镍和氢氧化钾中痕最银的测定,结果满意。     

高效液相色谱-电喷雾串联四级杆质谱法检测小鼠组织中花生四烯酸及其代谢产物

采用反相高效液相色谱梯度洗脱,电喷雾串联质谱多反应检测模式,同时分离测定小鼠组织中花生四烯酸类代谢产物.组织样品经低温超声破碎细胞,采用乙酸乙酯进行两次萃取,LC-MS/MS检测.实验用3个内标,标准溶液稀释法建立了19种花生四烯酸类物质的标准曲线.方法学确证表明: 各被测物质的线性相关系数均大于0.99;定量限(LOQ)为3～250 μg/L;相对回收率在70.7%～123.0%之间;方法重复性(RSD)均小于20%.运用本法在小鼠肺、肝、脾组织中检测到了几种花生四烯酸类代谢产物,并对肺组织里的8种代谢产物进行了含量测定,结果为11-羟基二十碳四烯酸(58.3±11.6)ng/g,15-羟基二十碳四烯酸(52.6±15.5)ng/g,前列腺素E2(210±102) ng/g,前列腺素D2(20.3±13.9)ng/g,前列腺素J2(39.2±15.9)ng/g,血栓素B2(58.3±28.4)ng/g,前列腺素F2α(3.8±6.0) ng/g,花生四烯酸(1980±544)ng/g.本方法灵敏度高、重复性良好,为研究生物组织样品中花生四烯酸类物质的代谢状况提供了分析基础.     

血管外膜肌成纤维细胞分化相关蛋白研究

为寻找涉及血管紧张素II (AngII)和转化生长因子β1 (TGF-β1)诱导的血管肌成纤维细胞(MF)分化的蛋白, 本研究采用双向电泳和质谱从整体水平检测了MF分化前后蛋白表达谱的变化, 共找到41个差异表达的蛋白点, 表达水平和/或蛋白位置在Ang II和TGF-β1刺激后都发生明显变化的蛋白点14个, 4个蛋白上调, 6个蛋白下调, 2个蛋白位置发生明显变化, 2个蛋白表达上调，位置也发生变化; 只在Ang II诱导的MF中表达发生变化的蛋白20个, 只在TGF-β1诱导的MF中表达发生变化的蛋白7个. 选取Ang II和TGF-β1共同调节的14个蛋白进行质谱鉴定, 结果除骨架蛋白外, 首次发现MF分化同泛素蛋白酶体系统和嘌呤合成有关; septin 2的下调可能是成纤维细胞分化的标志. 本研究运用蛋白质组学技术发现了新的参与MF分化的蛋白质, 为进一步研究和干预细胞表型转化提供了新的思路和靶点.     

超高效液相色谱-串联质谱法鉴定与分析乙醛诱导脱氧核糖核苷酸加合物

采用超高效液相色谱-串联质谱法对两种非对映异构体（6S,8S）1,N²-丙基-2'-脱氧鸟苷（ProdG）和（6R,8R）ProdG加合物进行鉴定与分析。通过色谱保留时间及质谱碎裂方式分析,证明乙醛与2'-脱氧鸟苷（dG）反应可形成ProdG加合物。体外实验表明,乙醛能够诱导脱氧核糖核苷酸（DNA）形成ProdG加合物,并且（6R,8R）ProdG的生成量大于（6S,8S）ProdG的生成量。细胞实验结果显示,乙醛暴露能显著提高人肺胚成纤维细胞（MRC5）基因组DNA中ProdG加合物的水平,且ProdG加合物的水平与乙醛的暴露浓度呈正相关。此外,100 μ mol/L的乙醛暴露使（6R,8R）ProdG的含量从（6.4±0.3） 个/10⁸个碱基增加到（127.2±2.7） 个/10⁸个碱基,上调程度大于（6S,8S）ProdG（从（6.5±0.3） 个/10⁸个碱基增加到（115.3±2.5） 个/10⁸个碱基）。该工作为乙醛暴露所引起的DNA加合物水平上升提供了实验依据。     

连接蛋白基因表达与横纹肌肉瘤分化关系研究

报道了用间隙连接蛋白Cx43基因探针斜缝杂交,Cx43和肌专一蛋白免疫荧光染色和罗氏黄荧光传输法观察到人横纹肌肉瘤(RD细胞系)的分化异常,细胞通讯缺陷,Cx43表达下降。单细胞克隆亚系RDL6增殖活跃,分化差,细胞通讯缺陷,Cx43表达很低;另一亚系RDL3增殖慢,有明显肌分化,通讯功能强,Cx43及其mRNA的表达近似正常成肌细胞。Cx43 cDNA+neo基因转染RDL6得到Cx43稳定表达的克隆RDL6/C-4,其通讯功能恢复,增殖抑制,成肌性分化增强。本结果证明RD细胞分化阻断与Cx43降表达有关。Cx43的功能性表达不仅抑制瘤细胞增殖,而且与瘤细胞向正常分化有正相关性。