基于超大孔聚合物微球的混合色谱模式层析介质的制备

以甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚的超大孔聚合物微球为基质,采用聚乙烯亚胺和丁基缩水甘油醚先后衍生微球的表面,制备成兼具阴离子交换与疏水相互作用的混合色谱模式层析介质。考察离子交换基团、疏水配基密度对蛋白载量、回收率的影响,结果表明,在离子交换容量0.2~0.5 mol/mL范围内,随着介质离子交换容量的增大,蛋白载量及回收率均呈增加趋势,蛋白载量最高值达40 mg/mL,回收率大于90%。当疏水配基的密度大于0.03 mol/mL时,介质开始表现疏水相互作用。此超大孔混合模式色谱介质在大于2000 cm/h 的流速下依然能保持低于2 MPa 的柱背压,同时在高流速下(2880 cm/h)纯化人血清中的抗体应用中表现良好的分辨率。此介质在高通量分离纯化应用方面具有巨大潜力。     

促卵泡激素的径向色谱纯化工艺

 比较了径向离子交换色谱与经典离子交换色谱在纯化工艺放大过程中的分离效果 ,证实了径向色谱比经典色谱更适合于促卵泡激素 (FSH)的纯化 ,并建立了适合于大规模生产FSH的径向色谱纯化新工艺。纯化后FSH的比活性为 180IU/mg ,活性回收率为 5 6 % ,产品质量符合国家药典规定。     

高效阳离子交换法分离纯化蛋清中的溶菌酶

 建立了用高效阳离子交换分离纯化蛋清中溶菌酶的新方法 ,讨论了纯化的工艺条件。蛋清样品匀浆后 ,用氯化钠初步纯化 ,然后用弱阳离子交换柱XIDACE WCX分离。结果表明 ,被纯化的溶菌酶和杂蛋白得到很好分离。经活性检测 ,溶菌酶过柱后的活性回收率为 10 7% ,蛋白的比活为 15 4 6 7U/mg ,纯化倍数提高了 5 6倍。用尺寸排阻 (SEC)鉴定 ,得到的溶菌酶呈均一性。该法较传统软基质低压离子交换分离速度快 ,纯化效率高。     

高效离子交换膜色谱介质制备及其对蛋白质的分离

制备了一种以纤维素膜为基质,以二乙胺为配基的高效液相离子交换膜色谱介质,并考察了不同柱长、不同洗脱梯度、不同流速下其对几何标准蛋白的分离情况。与高效液相柱色谱相比,这种高效液相膜色谱柱可以更快速的达到蛋白质的分离。即使在较高流速下,柱压仍较低。实验表明,这种高效液相膜分谱柱适合于蛋白质的快速分离。     

双孔色谱介质的制备和质粒DNA快速色谱纯化

以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体,二甲基丙烯酸乙二酯为交联剂,环己醇与十二醇为有机致孔剂,200 g/L的碳酸钙悬浮液为内水相(超孔致孔剂),用二次乳化法制备了(W/O)/W乳液,通过紫外光引发悬浮聚合生成两类孔型高分子微球(DEA-B).DEA-B孔径为双峰分布,范围分别为50~200 nm和500~5000 nm.其体积平均粒径、湿密度与不含超孔的微孔介质(DEA-M)接近.在流速为0.5 mL/min(150 cm/h)及相同的洗脱条件下,比较了所制备的微孔色谱介质填充的色谱柱与双孔色谱介质填充的色谱柱对5.4 kb质粒DNA的分离效果.结果表明,仅双孔介质色谱柱可以纯化质粒DNA,并且可以在1500 cm/h的高流速下得到色谱纯的质粒DNA,证明该双孔色谱介质可以用于质粒DNA的高速分离.     

高效液相色谱在生物医药研究中的应用第三讲蛋白质的反相高效液相色谱分离

近十年来,高效液相色谱(HPLC)在蛋白质分离纯化方面取得了很大的进展,并得到了广泛的应用。HPLC包括排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱、疏水反应色谱以及反相色谱等,几乎已在蛋白质分离各种传统方法中得到应用。这些方法在蛋白质分离中各有其地位,但到目前为止人们普遍认为反相高效液相色谱(RP-HPLC是分离纯化蛋白质的最有效的方法     

蛋白质制备色谱的研究

研究了蛋白质纯化制备的二种运行模式,其一,在色谱柱超载下纯化制备蛋白质模式,并成功地用离子交换色谱纯化制备了大豆中的胰蛋白酶,用反相液相色谱纯化了细胞色素Ｃ;其二,用溶质－溶质顶替色谱纯化制备了核糖核酸酶－Ａ,并对顶替色谱过程中诸参数进行了讨论和选择。     

在线单柱二维液相色谱法对蛋清中三种活性蛋白的快速分离纯化

基于一种新型的强阳离子交换/疏水色谱(SCX/HIC)双功能色谱柱构建了在线单柱二维液相色谱(2DLC-1C), 分离系统实现了自动控制, 可在线进行样品收集、二维进样和二维色谱分离. 采用SCX-HIC 2DLC-1C, 在120 min内可将8种标准蛋白完全分离, 并成功应用于鸡蛋清中三种活性蛋白质的分离纯化. 结果表明利用在线2DLC-1C技术可在70 min内完成对鸡蛋清中溶菌酶、卵清蛋白和卵转铁蛋白三种活性蛋白的快速分离纯化, 其纯度分别为95%、93%和97%. 该方法减少了样品的处理步骤, 对样品的污染小, 纯化速度快, 操作简单, 易于实现自动化和放大, 对活性蛋白的快速分离制备和工业化生产具有广阔的应用前景.     

氨基己酸为配基的新型弱阳离子交换/疏水双功能色谱固定相对蛋白质的分离纯化

以硅胶为基质、氨基己酸为配基制备了一种新型弱阳离子交换/疏水（WCX/HIC）双功能混合模式色谱固定相。该固定相配基具有一定的疏水性且含有羧基,在高盐浓度下表现为HIC的性质,可作为HIC固定相使用;在低盐浓度条件下表现为离子交换的性质,可作为WCX固定相使用。分别考察了该介质在WCX和HIC两种模式下对标准蛋白质的分离性能,并与商品柱进行比较。结果表明,所合成的WCX/HIC双功能固定相在WCX和HIC两种模式下对蛋白质均有较高的分离度和选择性,且分离能力与商品柱相当,两种模式下标准蛋白质的质量和活性回收率均大于93%,表明该柱具有“一柱二用”的功能,适于生物大分子的分离纯化。基于此双功能色谱柱构建的在线单柱二维液相色谱（2DLC-1C）可在60 min内实现8种蛋白质的快速分离。在70 min内完成了对蛋清中溶菌酶的二维纯化,纯度可达到98.3%。该技术中一根色谱柱可当作两根色谱柱使用,对蛋白质组学研究和重组蛋白药物的生产具有重要的应用价值。     

亚油酸甲酯硅胶聚合物键合相的制备及对蛋白质的分离

1　引　　言从现代分离科学理论计算得出 ,色谱和电泳是目前所知道最好的两种分离方法 ,但是 ,因受各种因素的限制 ,电泳目前尚不能用于生产规模的生物大分子的分离和纯化。这就是把分离和纯化生物大分子 (包括蛋白质、酶、核酸、多糖等 )的研究重点放在色谱上的原因。在生物技术制取蛋白质的多级纯化过程中 ,液相色谱是一个必需步骤。为了获得生物大分子的快速分离就得从基质到键合基团不断改进色谱柱填料。在本文中介绍的柱填料是键合在大孔硅胶上的乙烯基与亚油酸甲酯和二乙烯基苯共聚形成的。从蛋白质混合样品洗脱曲线看出这一填料具有…     

蛋白质高效分离两维色谱柱的选择优化

为了构建高效的离子交换/反相二维液相色谱(IEC/RPLC)分离平台系统,提高复杂蛋白质样品的分离效率,对色谱柱进行了评价与筛选。通过对实际人肝蛋白质样品的分离效果的比较,选择确定了TSKgel DEAE-5PW弱阴离子交换色谱柱(WAX)作为第一维色谱分离柱;考察了同一规格的10支代表性反相色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 30 nm, C4、C8或C18),通过评价其对尿嘧啶、硝基苯、萘和芴的分离性能以及对3种标准蛋白质样品的非特异性吸附、对人肝蛋白质样品的WAX馏分的分离效果,最终确定以Jupiter 300 C4反相色谱柱作为第二维色谱分离柱。对两维色谱柱的选择优化为蛋白质高效分离二维液相色谱平台的搭建提供了可靠基础。     

增强型绿色荧光蛋白的色谱分离和纯化

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是生物领域常用的标记物。在前期成功克隆表达EGFP的基础上,本实验建立了两步分离纯化EGFP的色谱方法,并验证其分离纯化效果,检验EGFP的活性。首先用金属螯合亲和色谱柱HisTrap HP对EGFP的重组菌体破碎上清液进行初步分离,再用葡聚糖凝胶排阻色谱柱Sephadex G-10 HR对其进行脱盐纯化。采用丙烯葡聚糖凝胶排阻色谱柱Sephacryl S-300 HR和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测分离纯化后的EGFP纯度。最后通过荧光分光检测器和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)验证分离纯化后的EGFP是否具有荧光活性。结果表明该方法可以简便快速地分离纯化EGFP,纯度超过98%,同时保持了EGFP的荧光活性。     

强阴离子色谱法从毕赤酵母培养液中分离纯化重组巴西日圆线虫乙酰胆碱酯酶

提出了一种从基因工程毕赤酵母(Pichia pastoris)培养液中分离纯化重组巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)乙酰胆碱酯酶(NbAChE)的方法。采用Q-Sepharose Fast Flow强阴离子交换色谱柱对重组NbAChE进行了分离纯化。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,纯化物的活性峰为单一蛋白质带,其相对分子质量约为66000。该方法的活性回收率为52.6%,纯化因子为3.87;纯化后AChE的比活为 2837 U/mg。结果表明,该法是一种理想的分离纯化重组NbAChE的方法。     

亲水型高分子包敷大孔硅胶基质的弱阳离子交换填料用于蛋白质分离

报道用亲水型高分子包敷大孔硅在质的羧甲基型（ＣＭ）高效弱阳离子交换色谱分离蛋白质的工作。经ＣＭ柱纯化的溶菌酶比活性提高７倍，活性回收率高于９５％，ＣＭ填料对溶蓖酶的容量达８０ｍｇ／ｇ。     

高效逆流色谱法制备苏木中的氧化巴西木素

氧化巴西木素是苏木的主要化学成分之一,具有广泛的药理活性且常作为染色剂应用于各行各业。采用传统柱色谱法进行分离,不仅会造成色谱柱材料的污染,也会造成活性成分的损失。故采用高效逆流色谱(HPCCC)对苏木中的活性化合物氧化巴西木素进行分离纯化。苏木乙醇提取物经乙酸乙酯萃取后直接进行高效逆流色谱分离。首先利用基于薄层色谱的常用溶剂体系估算法和摇瓶法结合高效逆流色谱分析模式进行溶剂体系筛选。结果表明,最佳溶剂体系为氯仿-甲醇-水(4∶3∶2, v/v/v)。高效逆流色谱以反相模式为洗脱模式,主机转速为1600 r/min,流速为10 mL/min,分离温度为25 ℃,检测波长为285 nm,在氯仿-甲醇-水(4∶3∶2, v/v/v)溶剂体系下,从500 mg苏木乙酸乙酯萃取物中一次性分离制备得到15.2 mg纯度为95.6%的氧化巴西木素及一微量成分caesappanin C。采用高效逆流色谱分离制备氧化巴西木素,可避免苏木中的活性成分氧化巴西木素对色谱柱中的固体填充材料染色和难以洗脱等问题,并缩短分离纯化工作时间,提高工作效率。故可将高效逆流色谱应用到苏木中其他色素化合物或其他染料植物的分离制备工艺研究中。     

磺酸甜菜碱型两性离子亲水毛细管整体柱制备及应用

以3-[N,N-二甲基-[2-(2-甲基丙-2-烯酰氧基)乙基]铵]丙烷-1-磺酸内盐(SPE)为功能单体,季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)为交联剂,环己醇和乙二醇(EG)为致孔剂,通过原位聚合法制备磺酸甜菜碱型两性离子亲水毛细管整体柱。优化单体、交联剂和致孔剂的比例等因素,考察了不同SPE含量对整体柱性能和选择性的影响。在最优制备条件下,以苯酚类化合物、烷基苯类化合物和苯甲酸类化合物为分离对象,评价该整体柱的色谱性能以及分离机理。在不同的色谱条件下,该整体柱具有亲水、疏水以及离子交换作用。此整体柱在0.05 m L/min的流速下(线速度为0.265 mm/s)分离烷基苯类化合物时,柱效高达41000~56000 plates/m,该整体柱重现性良好,连续运行的重现性(RSD)低于1.2%。在亲水/离子交换色谱模式下,该整体柱可应用于核苷和碱基的高效分离。     

蛋白蛋分离与纯化过程中高效离子交换色谱柱的再生

高效离子交换色谱法分离和纯化蛋白质时,蛋白质在色谱柱上的不可逆吸附使柱效降低,柱压升高。本文使用2％的胰蛋白酶溶液在37℃下处理TSKgelCM-5PW和TSKgelDEAE-5PW（7×7．5mmI.D.）离子交换色谱柱24h后,柱压显著降低,柱效提高4~13倍,交换容量也得到恢复。离子交换色谱柱的恢复程度和交换容量与处理液的用量有关。     

基因工程人表皮生长因子的分离纯化及其浓度的在线检测

在分离纯化快速开拓系统(AKTA explorer 100)中用凝胶(Sephadex G—50 superfine)纯化人表皮生长因子,并在优化的条件下对人表皮生长因子(hEGF)进行定量测定?与经离子交换柱、SDS—PAGE及凝胶图象扫描分析系统的人表皮生长因子标准品间相互印证。结果表明在优化条件下,在SDS—PAGE上可得到与标准样品hEGF一样清晰的单条带,其产品纯度高于94％,检出限可达1μg／mL。该法不仅对人表皮生长因子的在线检测行之有效,而且对其它蛋白质分离的在线检测也具有参考价值。     

重组人干扰素-γ的制备与鉴定

用聚乙二醇200疏水相互作用色谱固定相(PEG200-STHIC)分别在色谱柱和色谱饼上完成了一步复性并同时纯化来源于大肠杆菌(E.coli)表达的重组人干扰素-γ(rhIFN-γ)。为了能使色谱分离方法用于不同来源的rhIFN-γ的纯化,对rhIFN-γ在反相色谱、离子交换色谱、固定化镍离子亲和色谱上的保留行为也进行了研究。色谱柱纯化的rhIFN-γ收集液经排阻色谱除盐和冷冻干燥得到rhIFN-γ干粉。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对rhIFN-γ干粉进行了测定,rhIFN-γ单体的相对分子质量为17184.0,二聚体的相对分子质量为34204.4。用细胞病变抑制法(CPEI)测定rhIFN-γ干粉的比活性为9.5×108 IU/mg。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定rhIFN-γ干粉的纯度高于95%。用色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ的质量回收率达到93.7%,纯度高于95%,比活性为4.3×107 IU/mg。结果表明,采用PEG200-STHIC色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ是一种十分高效的方法。     

用于变性蛋白质复性及同时纯化的简易型色谱柱的研制及其应用

研制出一种简易型色谱柱并通过装填大颗粒的疏水色谱填料对色谱柱的性能进行了考察,该柱的外形和操作如同传统的液相色谱柱,但它却在生物大分子分离方面有着和高效液相色谱相似的分辨率。另外,只要给该柱装填合适的固定相,比如疏水相互作用色谱固定相,便可用于蛋白质的复性及同时纯化。实验考察了该色谱柱的结构、操作和性能,包括柱压、柱寿命及对蛋白质的分辨率等。以溶菌酶为模型蛋白质,实验测得其在初始浓度为50.0 g/L时的质量回收率和活性回收率分别为(96.6±1.3)%和(101.1±6.0)%。这种简易型色谱柱价格低廉