固定金属离子亲和色谱--蛋白质分离的方法、原理、特性和应用

介绍了固定金属离子亲和色谱法(IMAC)的方法原理、金属螯合柱的制备、固定金属离子与蛋白质的相互作用以及影响这些作用的因素、不同色谱条件下各种作用力对蛋白质保留值的贡献、蛋白质的洗脱原理和IMAC在蛋白质分离纯化中的应用,论述了IMAC的特点、不足、克服的方法和今后应解决的问题。     

高效阳离子交换法分离纯化蛋清中的溶菌酶

 建立了用高效阳离子交换分离纯化蛋清中溶菌酶的新方法 ,讨论了纯化的工艺条件。蛋清样品匀浆后 ,用氯化钠初步纯化 ,然后用弱阳离子交换柱XIDACE WCX分离。结果表明 ,被纯化的溶菌酶和杂蛋白得到很好分离。经活性检测 ,溶菌酶过柱后的活性回收率为 10 7% ,蛋白的比活为 15 4 6 7U/mg ,纯化倍数提高了 5 6倍。用尺寸排阻 (SEC)鉴定 ,得到的溶菌酶呈均一性。该法较传统软基质低压离子交换分离速度快 ,纯化效率高。     

气相色谱中保留值与进样量的关系

提出了测量气相色谱中吸附等温线的新方法，用不同进样量下测定的容量因子计算平衡时气-固两相组分浓度。利用建立的方法分别测量了正-己烷、正-壬烷和正-十一烷在邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、阿皮松-L(Apiezon)和β，β′-氧二丙腈(ODPN)柱上的吸附等温线，讨论了色谱峰形状与吸附等温线的对应关系。研究了气相色谱中进样量对保留值的影响，利用佛伦德利希(Freundlich)吸附等温式导出了描述保留值与进样量关系的数学表达式。理论和实验证明，保留值与进样量具有良好的对数线性关系。     

蛋白质在固定Zn2+金属螯合亲和色谱中的变性热力学

在15~85℃宽温度范围,研究了蛋白质在固定Zn2 金属螯合色谱系统中的热行为和变性热力学。实验结果表明,蛋白质在色谱过程都有一个固定的热转变温度:核糖核酸酶(RNase)、α-胰凝乳蛋白酶原A(α-Chy)的热转变温度约为55℃,细胞色素C(Cyt-C)和溶菌酶(Lys)约为65℃;,热转变温度的出现标志蛋白质构象发生变化;利用Van′tHoff作图测定了蛋白质在色谱系统热变性时的标准焓变ΔH°和标准熵变ΔS°,提出用标准熵变ΔS°和自由能变ΔG°判断蛋白质构象变化;利用ΔH°-ΔS°的线性关系估算了蛋白质热变性时的补偿温度,鉴定了蛋白质各变体在金属螯合色谱中保留机理的同一性,RNase、Cyt-C、Lys和α-Chy的补偿温度分别为55℃、65.8℃、65.2℃和54.8℃;根据蛋白质热变性时的补偿温度和构象变化熵变Δ(ΔS°)的大小,讨论了蛋白质在阳离子交换色谱和固定Zn的金属螯合色谱体系中的热稳定性。实验证明,在IDA裸柱引入Zn2 后蛋白质在色谱系统中的热稳定性减小,平均补偿温度从65.3℃降低到59.7℃,而构象变化熵变的绝对值大幅度升高。     

金属螯合亲和色谱中的疏水作用

通过考察盐溶盐和盐析盐浓度对蛋白质在IDA裸柱和金属螯合柱上保留行为的影响,详细研究了金属螯合色谱中的疏水作用,疏水作用的发生、形成的条件以及不同条件下对蛋白质保留值的贡献。实验结果表明,在高浓度和低浓度的盐溶盐以及低浓度盐析盐中,蛋白质在金属螯合柱上的保留主要受静电和配位作用控制,而疏水作用对蛋白质的保留影响很小。对弱亲和性的金属螯合柱以静电作用为主,其大小可用参数Q表征;对强亲和性的IDA-Cu（Ⅱ）柱以配位作用为主。仅在高浓度的盐析盐中,金属螯合柱才呈现较强的疏水作用,支配蛋白质保留。实验证明,金属螯合色谱中疏水作用主要来自固定相间隔臂中的疏水碳链和盐析盐对蛋白质的增疏作用,利用这种疏水作用有可能改善金属螯合色谱分离的选择性。     

胍变蛋白的构象变化及尺寸排阻色谱行为

通过比较６种天然和变性蛋白的色谱行为，提出在不含盐酸胍的非变性体系中利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质的构象变化。根据色谱峰数可以判断蛋白质变性时形成变体的数目；利用峰高可以描述蛋白质变性的完全程度；根据不同波长下峰高的变化可以推断蛋白质表面氨基酸残基暴露情况；利用保留时间可以比较各种变体相对体积的大小。     

硅胶基质弱阳离子交换剂的合成及蛋清中溶菌酶的分离

用间接法合成了硅胶基质弱阳离子交换剂（ＸＩＤＡＣＥ－ＷＣＸ）,详细研究了合成填料的色谱性能,并与商品柱（Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ ＷＣＸ－１和Ｐｏｌｙ ＣＡＴＡ）进行了比较。结果表明：合成柱比商品柱具有较高的分辨能力。通过考察合成填料的疏水性、蛋白质的保留值与等电点（ｐＩ）的关系、流动相的ｐＨ值和盐浓度对蛋白质保留行为的影响,论证了合成填料的离子交换特征。利用合成的色谱填料从蛋清中分离出纯度较高的溶菌酶     

铜离子固定金属亲和色谱在生物大分子中的应用

铜离子固定金属亲和色谱作为一种有效的分析方法,已普遍应用于生物大分子的分离与纯化.本文从理论和应用两个方面就新型基质、螯合配体、色谱动力学、联用技术以及蛋白质分离纯化、复性等方面进行了评述.     

利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质的变性

通过比较蛋白质变性时的色谱行为和生物物理特性，提出利用尺寸排阻色谱法研究蛋白质变性时的构象变化，根据色谱参数中保留时间，比较蛋白质变性时体积的相对变化，利用色谱峰数，确定形成变体的数目，根据峰形和峰数的变化，描述蛋白质的伸展程度，利用不同波长下峰高的变化，推断蛋白质变性芳香族基酸残基的暴露情况，利用建立的尺寸排阻色谱观察了液体和固液α－淀粉酶在低温下放置时的变性情况，讨论了变性时间和变性温度对蛋白     

辣椒素的分析方法比较

采用可见、紫外分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)对辣椒不同部位的辣椒素含量进行了对照分析,同时用上述三种方法对色素、辣椒精及辣椒素晶体的辣椒素含量进行了对照分析。分析结果表明,HPLC方法与前两种方法相比,具有方法可靠、测得的结果准确度高等优点。