NanoLC-ESI MS/MS对重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的准确鉴定

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋白(商品名益塞普)是一种用于治疗中度及重度活动性类风湿关节炎的重组蛋白药物.该药由肿瘤坏死因子受体和人IgG1的FC片段融合而成.国内的药品报批时,没有明确规定必须为人IgG1的FC片段.但该药品出口到国际市场时,要求必须确定为人IgG1的FC片段.人IgG共有4个亚型,序列高度同源.为准确鉴定人IgG1,本实验应用超高效纳升液相色谱一高解析离子淌度质谱仪HDMS进行了分析,结果表明重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体一抗体融合蛋白一级结构正确,FC片段确实为人IgG1,符合出口国际市场的标准.     

溴化氰裂解结合电喷雾串联质谱测定电泳分离蛋白的C端序列

C端测序是蛋白质及多肽一级结构确认的重要组成部分,也是重组蛋白药物质量控制的重要依据。建立了溴化氰裂解结合电喷雾串联质谱测定蛋白质C端序列的方法,并应用于重组人肿瘤坏死因子受体和纽兰格林的C端测序。首先根据待测蛋白序列进行溴化氰理论裂解,如果C-端肽段理论分子量在500~5000U之间,则将待测样品进行SDS-PAGE分离,考马斯亮兰染色,然后进行胶内溴化氰裂解,最后应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定C-端肽段的分子量,电喷雾串联质谱对C端肽段进行测序。应用本方法分别测定了这两个蛋白质C端19个和11个氨基酸残基序列。研究结果表明:本方法灵敏、有效、实用性较强,可适用于部分重组蛋白药物的质量控制和蛋白质的结构确证,是对目前蛋白质C端测序方法的有效补充。     

亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱法鉴定水稻蛋白质

建立了亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱分析水稻叶片蛋白质组学的方法。利用标准肽段系统分析了液相色谱流动相酸碱度对二维亲水作用-反相色谱系统正交性的影响。结果表明,第一维亲水作用色谱在碱性(pH 9.3)和第二维反相色谱在酸性(pH 3.3)的条件下,正交性最佳(R~2=0.34113)。在此基础上,结合馏分收集技术进一步评价了本测试系统在水稻叶片蛋白质分析中的正交性。结果表明,在所有馏分收集组分中,鉴定次数小于2次的水稻叶片肽段占总肽段数目的 50%以上,且一维液相色谱馏分收集的肽段在第二维色谱及质谱分离分析中,可以较好地分布在不同时间段的洗脱窗口,表明本研究建立的亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱结合馏分收集技术在复杂水稻叶片蛋白质分离鉴定中可提供良好的的分离正交性。结合水稻蛋白质数据库检索,共鉴定出207345个肽段,归属于2930个蛋白质簇。     

基于直接注射-多级质谱全扫描技术的人血红蛋白快速肽图分析

利用液相色谱–串联质谱法(LC-MS/MS)进行肽图分析,是目前单克隆抗体等蛋白类药物质量控制的主要方法,然而,LC-MS/MS分析具有费时、费溶剂和成本高等缺点。本研究以人血红蛋白(Human hemoglobin, Hb)为例,考察利用直接注射–多级质谱全扫描技术(DI-MS/MS^ALL)进行肽图分析的可行性。Hb经胰蛋白酶水解后,多肽样品通过流动注射泵直接注入QTOF-MS离子源,采用MS/MS^ALL记录MS¹谱图以及每个单位质荷比窗口(1 Da)的MS²谱图信息,所获得的质谱信息与Skyline软件给出的21个理论肽段质谱信息进行匹配,初步指认了20个肽段。常规的LC-MS/MS肽图分析检测出了所有21个理论肽段。DI-MS/MSALL的MS¹图谱与LC-MS/MS的平均MS¹图谱相近,主要为各肽段带电荷数1～4的准分子离子信号,以双电荷为主,而MS²图谱均以y⁺离子为主。因此,DI-MS/MS^...     

液相等电聚焦技术结合液相色谱-质谱联用技术分析鼠肝全蛋白

利用液相等电聚焦预分离技术结合液相色谱-质谱(LTQ-Orbitrap)联用技术,研究了C57小鼠肝脏的蛋白质表达谱.质谱分析结果采用Max Quant1.4.1.2软件搜索数据库,共鉴定出3474个蛋白(2个以上唯一肽段).用DAVID在线工具、GO分类工具和IPA软件对鉴定蛋白进行生物信息学分析,单独发现832个新蛋白.研究结果表明,通过基于等电点和亲疏水性的两维分离,提高了质谱鉴定蛋白数,可以鉴定出更多低丰度蛋白.     

基于特征肽段的液相色谱-质谱技术鉴定胶原蛋白的物种来源

建立了一种基于特征肽段的液相色谱-质谱技术鉴定胶原蛋白物种来源的方法。样品经蛋白提取,还原,烷基化,胰蛋白酶消化后,采用Eksigent C18色谱柱(75μm×150 mm,3μm)分离,用流动相0. 1%甲酸水-乙腈溶液(98∶2)和0. 1%甲酸乙腈-水溶液(98∶2)梯度洗脱,在正离子模式下,通过纳升电喷雾四极杆飞行时间质谱进行检测,数据经Protein PilotTM软件及blast分析,筛选出潜在的特征肽段。消化后的样品再采用Eclipse Plus C18色谱柱(2. 1 mm×100 mm,1. 8μm)分离,用流动相乙腈和1%甲酸水溶液梯度洗脱,在正离子模式下,通过电喷雾四极杆/线性离子阱串联质谱的多反应监测触发增强子离子扫描模式进行检测,进一步确认肽段的特异性。最终筛选并确证了3种猪源性胶原蛋白特征肽段,4种牛源性胶原蛋白特征肽段,1种羊源性胶原蛋白特征肽段。所筛选的特征肽段具有良好的耐热性,可为动物源性胶原蛋白鉴定提供一种特异性强、准确可靠的检测方法。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定乳与乳制品中牛乳铁蛋白

建立了超高效液相色谱-串联质谱技术定量检测乳制品中牛乳铁蛋白含量的方法。样品经脱脂、酶解后,利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q/Exactive-HRMS）和Protein Pilot软件分析,实现了乳铁蛋白及其肽段的鉴定;通过初级局部序列搜索工具（basic local alignment search tool,BLAST）与Uniprot数据库对比分析筛选出牛乳铁蛋白的8个特征肽段;选择其中3个响应强度高、稳定性好的特征肽段进一步通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-QqQ-MS）进行验证和多反应监测（MRM）定量研究,并考察了空白基质匹配的外标法和内标法对乳铁蛋白检测结果的差异。采用外标法定量时,3个肽段在各自范围内线性关系良好,检出限为0.023~0.041 mg/kg,定量限为0.077~0.137 mg/kg,平均回收率为93.8%~103.9%,日内精密度≤8.8%,日间精密度≤9.5%。该方法抗干扰能力强,灵敏度高,重复性好,适用于乳及乳制品中牛乳铁蛋白的含量测定。     

小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

目的:制备B7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用.方法:首先采用PCR技术分别从pMD19-T/小鼠B7-H3和pMD19-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因.通过重叠PER技术将2段基因连接成B7-H3-Fc,经EcoR I和Bgl Ⅱ双酶切后插入真核表达载体plRES2-EGFP构建成pIRES2-EG-FWB7-H3-Fc重组载体.脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选能稳定分泌表达小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞,并经Western blot鉴定.该转基因细胞无血清培养后,收集细胞上清、超滤浓缩后行经Protein G柱纯化,获得纯品B7-H3-Fc融合蛋白.通过CCK-8以及ELISA方法检测小鼠B7-H3-Fc融合蛋白对T细胞体外增殖及细胞因子分泌的影响.结果:成功地构建了能稳定表达B7-H3-Fc融合蛋白基因的CHO转基因细胞株,该融合蛋白能够剂量依赖性地促进T细胞体外增殖及IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌.结论:本研究提示B7-H3作为重要的共刺激分子,在调节T细胞免疫应答中发挥了正性共刺激作用.     

纳升电喷雾串联质谱鉴定重组人甲状旁腺素(1-34)

用先进的纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱鉴定重组人PTH(1-34)。通过ESI-MS测定重组人PTH(1-34)分子量及MS/MS对其胰蛋白酶酶解后的肽段的序列和数据库查询进行结构鉴定。重组PTH(1-34)测定分子量为4115.21,与理论值相比测定相差0.06%。MS/MS测定出其中双电荷离子峰m/z728.4肽段序列为VSEIQLMHNLG,以及其他3个单电荷离子峰的序列。数据库检索后确定重组表达的PTH(1-34)一级结构完全正确,纳升电喷雾串联质谱以其灵敏、快速和准确为蛋白质鉴定提供了有效的手段。     

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物组织中阿莫西林与多占菌素E的残留量

建立了动物源性食品中阿莫西林和多粘菌素E残留检测的超高效液相色谱-串联质谱( UPLC - MS/MS)分析方法.组织样品经三氯乙酸溶液提取,同时用乙酸铅沉淀蛋白,经正己烷除脂后,再用HLB固相萃取柱净化,浓缩后用超高效液相色谱-串联质谱仪检测,以基质匹配标准溶液定量.结果表明,阿莫西林和多粘菌素E的检出限( LOD,...     

肝移植后人血清中差异表达蛋白质的纳升超高效液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定

建立了基于质谱的人肝移植后血清中差异表达蛋白质的分析方法,肝移植前后的人血清蛋白质用双向凝胶电泳分离,AgNO3染色,差异蛋白质斑点用胰蛋白酶进行胶内酶解后,采用纳升超高效液相色谱-电喷雾串联质谱进行鉴定。鉴定了8个显著差异表达的蛋白质,Mascot检索分值101~1543分,肽段匹配数5~34个,序列覆盖率10%~43%。所发现的差异蛋白质多与免疫调节有关,可为深入研究肝移植术后免疫排斥的分子机理提供线索。     

肿瘤坏死因子与可溶性受体之间相互作用的动力学研究

采用表面等离子体共振(SPR)技术研究了肿瘤坏死因子(TNF)与其两种受体的胞外部分即可溶性受体(TNF sRI/Fc Chimera和TNF sRII/Fc Chimera)的相互作用的动力学性质。采用两种方式进行研究:在传感片上氨基偶联固定TNF,测定其与溶液中两种可溶性受体相互作用;在传感片上固定Protein A,通过其与嵌合蛋白TNF sRI/Fc Chimera和TNF sRII/Fc Chimera分子上Fc片段的特异性作用,将可溶性受体"捕获"固定在传感片上,再测定受体与溶液中TNF的相互作用。结果表明,两种固定方式测定的动力学参数相吻合,TNF与其可溶性受体的亲和常数KD大于10"9mol/L,远高于一般抗体-抗原间的亲和常数(KD=10"5～10"7mol/L)。     

毛细管反相液相色谱-串联质谱用于肽的鉴定和相对定量分析

建立了一种基于毛细管反相液相色谱-串联质谱联用技术和质谱峰强度数据处理的肽段鉴定和相对定量分析方法。该方法无需对样品中的肽进行化学标记,在对样品进行反相色谱分离和串联质谱分析后,将二级质谱扫描数据进行蛋白质数据库搜索,获得所鉴定肽段的序列、保留时间、质荷比、带电荷数等定性信息;再以此为定位依据,在全扫描质谱数据中提取该肽段对应的离子峰并以该离子峰的峰强度作为定量信息,从而实现对不同样品中的共有肽段进行差异比较分析。以标准蛋白酶解混合肽段为实验对象,以肽段相对强度的相对标准偏差为指标,考察了该方法用于肽段相对定量分析的重现性、检测动态范围以及浓度标准曲线等,为将该方法用于生物样品中内源性肽的差异分析奠定了基础。     

全二维微柱液相色谱-质谱鉴定人胃癌组织中的差异蛋白质

构建了以阳离子交换色谱-反相色谱(SCX-RPLC)为分离模式的新型全二维微柱液相色谱-质谱分离平台.采用了醋酸铵缓冲液梯度洗脱,实现了第一维肽段的分步洗脱,洗脱的肽段经富集除盐后通过接口进入反相色谱微柱,通过线性梯度实现第二维进一步分离,最后进入质谱进行检测.采用此平台分析了人胃癌组织与正常组织提取蛋白质信息,其中正常胃组织鉴定蛋白质数为537个,而癌症组织鉴定蛋白质数目为506个.对胃癌和正常组织两种提取蛋白质酶解产物的蛋白质检索结果进行比较分析,将鉴定的蛋白质按照物理性质进行分布,找出正常组织与癌症组织间蛋白质差异,筛选出一种可能发生变异的癌症特有蛋白.     

反相高效液相色谱双梯度洗脱分离肽混合物及质谱分析

复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提。“鸟枪法”(Shotgun)蛋白质组学研究策略通常采用蛋白酶切、二维液相色谱-串联质谱分析肽段混合物从而鉴定蛋白质,其中高效率地分离肽段混合物是关键步骤之一。本文通过pH梯度结合有机溶剂梯度的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行一维液相色谱分离,按等时间间隔收集馏分并将一个梯度的前段的一个馏分与后段一个馏分混合,然后进行纳升级液相色谱-质谱联用(nanoRPLC-MS/MS)分析。将该方法应用于酵母蛋白质的分离和鉴定,实验结果为: 与常规的强阳离子色谱-反相液相色谱-质谱分离鉴定方法相比,采用pH梯度结合有机相梯度的RP-HPLC-RPLC-MS分离鉴定方法多鉴定到567个酵母蛋白质(簇,含有3035个唯一肽段);其中鉴定到肽段的pI分布范围为3.42～12.01,相对分子质量范围为587.67～3499.79;蛋白质的pI分布范围为3.82～12.19,相对分子质量范围为3446.55～432905。该结果表明这种方法在复杂体系蛋白质组分离鉴定中具有明显的优势,在蛋白质组学研究中有较好的应用前景。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉、鸡蛋、牛奶中9种食源性兴奋剂类药物残留

β-受体激动剂、β-阻断剂、蛋白同化制剂属于兴奋剂类药物,在动物饲养和屠宰过程中的违禁使用成为食源性兴奋剂类药物残留的来源,危害人类健康.目前 β-受体激动剂、蛋白同化制剂的检测较多,β-阻断剂检测报道较少,动物源食品中 β-阻断剂检测尚无标准方法.该文建立了超高效液相色谱-串联质谱测定猪肉、鸡蛋、牛奶中 β-受体激动...     

高效液相色谱-串联质谱法测定肉制品和调味料中7种水产品过敏原

基于高效液相色谱-串联质谱系统建立了食品中水产品过敏原的快速筛查和定量检测方法。样品经蛋白质提取、纯化、胰蛋白酶解后，利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q/Exactive-HRMS）结合ProteinPilot软件，基于母离子和碎片离子谱分析，实现蛋白质和多肽的鉴定。再通过基本局部比对搜索工具（BLAST）与Uniprot数据库对比分析，筛选出南美白虾、大闸蟹、青蟹、金枪鱼、大西洋鲑鱼的7种过敏原蛋白的30个特征肽。利用高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-QqQ-MS）系统对特征肽进行验证和多反应监测（MRM）定量研究。结果表明，该方法在5~250 mg/kg范围内线性关系良好，检出限为2~3.5 mg/kg，平均回收率为88.7%~110.2%。该方法重现性好，通量高，可应用于肉制品和调味料中7种过敏原的快速筛查和定量分析。     

单克隆抗体-白介素2融合蛋白一级结构的确证

建立单克隆抗体-白介素2融合蛋白一级结构确证的方法.用基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定单克隆抗体-白介素2融合蛋白的精确相对分子质量,毛细管等电聚焦方法测定其等电点,通过N-末端氨基酸序列的测定以及肽图分析,证实了抗体-白介素2融合蛋白一级结构表达的正确性,同时为单克隆抗体-白介素2融合蛋白的质量标准研究奠定了基础.     

纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析尿液多肽组及其翻译后修饰

多肽组是指生物体表达的所有多肽,尿液等体液的多肽组是生物标记物的重要来源.本研究采用氧化石墨烯-磷酸镧纳米磁性复合材料分离富集尿液多肽,进行纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析,从单一样本中鉴定了归属于123个蛋白质的790条肽段.研究表明,这些肽段在蛋白质水平上不是平均分布的.此外,本研究检测到了肽段的氧化、磷酸化和脱氨化等翻译后修饰现象,观察到了尿液多肽的阶梯序列性,从蛋白水平上对尿液多肽组进行了生物信息学分析,结果表明,这些多肽所归属的大部分蛋白质之间存在相互作用.本方法可为在尿液中寻找疾病的标志物提供方法学支持.     

多维色谱串联质谱分析肝癌患者血浆中的低丰度差异蛋白

建立了分析肝癌患者血浆中低丰度差异蛋白的新的多维色谱串联质谱方法.以5例肝细胞癌(HCC)患者血浆为研究对象,选用免疫亲和色谱Agilent MARS Spin Cartridge去除血浆中6种主要高丰度蛋白;离线RP-HPLC预分级血浆低丰度蛋白并收集差异表达蛋白组;液相色谱-芯片(HPLC-CHIP,包含一支纳升级Zorbax 300SB-C18富集柱和一支纳升级Zorbax 300SB-C18分析柱)富集、分离差异表达蛋白组胰酶酶解肽混合物,线性离子阱质谱在线分析,以Spectrum Mill MS Proteomics Workbench自动分析MS和MS/MS数据后在UniProtKB/SWISS-PORT数据库中进行搜索,鉴定得到27种差异蛋白,其中23种蛋白与各种疾病或肿瘤相关,IMP3、ARNT2和GRIP1可能成为诊断HCC的潜在生物标志物.