核酶的体外合成及其对烟草叶病毒RNA靶的作用

通过微机对烟草花叶病毒(TMV)RNA二级结构的分析并参照烟草环斑卫星病毒(sTobRV)的锤头型(hammer head)催化性RNA(即ribozyme或核酶)序列,我们在体外分别合成了以TMV移动蛋白(MP)基因区域正链和负链及正链3’末端序列为靶的锤头型核酶RZ1,RZ3和RZ2。体外结果表明,RZ1在50,37和30℃都能切割含有其靶序列的体外转录TMV RNA BT1(+)和BT2(+);与之相比,RZ3在50,37和30℃都只能部分切割靶RNA BT2(-)。至于RZ2,它对TMV正链3’末端内的靶序列的任何切割作用则未能观察到。我们在核酶RZ1的催化序列的茎环内或其3’末端引入了一个起稳定作用的序列CUUCGG以观察该序列对核酶的影响,实验表明这种修饰并不改变核酶的作用效率。     

RNA聚合酶体外转录PSTV cDNA的研究

酵母RNA聚合酶Ⅱ虽能在体外忠实转录PSTV,但不能转录相应的cDNA。大肠杆菌RNA聚合酶不仅能转录PSTV,还可转录其cDNA。根据对转录产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,Southern分子杂交以及非转录反应的排除实验确证:大肠杆菌RNA聚合酶转录PSTV cDNA 属于忠实性转录。本文首次提出 PSTVcDNA可以构成一个转录单位,其中含有能指导特异性转录起始的启动子区。证明此启动子区在Avall酶切后的132bp小片断上,很可能在5′端BamHl切点附近。     

马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。     

一株新黄瓜花叶病毒卫星RNA结构和生物学分析

从患香蕉花叶心腐病香蕉病叶分离的黄瓜花叶病毒中,发现一株新卫星RNA(定名为Ba-Sat)。以CMV卫星RNA两端保守序列为引物合成了Ba-Sat cDNA并将其克隆到载体pGEM7Zf(+)上。序列分析结果表明,Ba-Sat由390个核苷酸组成,其5′端、3′端各有一段序列与其它株系卫星RNA有很高的序列同源性,但其中间区域则无任何序列同源性。在此基础上,进一步分析了Ba-Sat的二级结构,并研究了Ba-Sat的生物学特征,实验结果证明Ba-Sat具有致弱卫星RNA的特性。     

水稻齿叶矮缩病毒RNA聚合酶的研究

在体外转录体系中,完整的水稻齿叶矮缩病毒能以四种游离核苷酸力底物,合成酸不溶性的多聚核苦酸,表明该病毒含有依赖于病毒双链RNA的RNA聚合酶。在离体条件下,该酶反应的合适温度范围为30°—40℃,以35℃最为合适。二价金属离子对酶活性是必需的。在0—4h保温时间内,酶反应产物量不断增加。此外,病毒经胰凝乳蛋白酶水解或加热处理后,聚合酶活力大大降低。     

MDMV外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

报道了玉米矮花叶病毒(MDMV)全长外壳蛋白cDNA基因的克隆、序列分析和表达产物鉴定的结果。根据其cDNA序列推测的外壳蛋白氨基酸顺序全长共有313个氨基酸,分子量总和为35 400 D,与聚丙烯酰胺凝胶电泳估算的值36 000 D相近,克隆的病毒外壳蛋白基因cDNA 3′-末端非编码区含有256个碱基。将此外壳蛋白的基因插入pUC19的1acZ基因中,转入E.coli后诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈现一特异性的蛋白带,经Western吸印与抗MDMV的兔血清呈阳性反应,证实所克隆的cDNA基因为MDMV外壳蛋白基因,并且能够正确表达。     

小麦丛矮病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶

本文证明小麦丛矮病毒含有依赖于RNA的RNA聚合酶,酶活力与病毒的核衣壳(NP)有关。NP的体外转录需要四种三磷酸核苷酸和Mg~2+,一定的盐浓度以及某些还原剂的存在能增大酶活力。通过SDS解聚和超迷离心可以将NP分解为上清和沉淀两个部分,上清含有NP的三种结构蛋白,L,N和NS;沉淀主要为病毒RNA。上清蛋白与病毒RNA的重新组合能再现病毒的RNA聚合酶活力,并且当蛋白与RNA的配比为100:7.7(W/W)时,RNA聚合酶重组活力达到最高。     

氧氟沙星噬菌体库的构建、筛选及抗体结构模拟

应用噬菌体展示和重组抗体技术制备抗氧氟沙星单链抗体(scFv)库,筛选获得氧氟沙星特异性噬菌体scFv以及同源模拟其三维结构。将从氧氟沙星杂交瘤细胞提取的总RNA,用RT-PCR反转录合成cDNA,以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的兼并引物,扩增获得VH和VL可变区基因,通过SOE-PCR法将VH基因和VL基因通过柔性多肽Linker(Gly4Ser)3拼接成全长scFv基因片段,将双酶切后的scFv基因片段插入T7噬菌体,经体外包装后转化宿主菌BLT5403,成功构建库容量为3×105pfu/mL的抗体库,经4轮吸附-洗脱-扩增的富集,采用直接竞争ELISA筛选到4个特异性噬菌体scFv,运用Expasy软件模拟特异性scFv的三维结构。为进一步大量表达氧氟沙星单链抗体奠定了基础。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子(1—35)的合成

本文报道了应用T_4RNA连接酶将酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))5′-半分子中的三个寡核苷酸片段[—13(Ⅰ);14—22(Ⅱ);23—35(Ⅲ)]连接成5′-半分子的工作。由于寡核苦酸片段的纯度高,多核苷酸激酶和T_4RNA连接酶的质量好,采用连续反应的方法,简化了分离步骤,使产物的得率大大提高,二十二核苷酸的连接率是75％,三十五核苦酸的连接率是90％,以第一步反应原料为基数计算,最终产物的总得率是21％。经连接点和末端核苷酸分析,证明它的结构是正确的。将合成的5′-半分子与天然的3′-半分子在T_4RNA连接酶的催化下连接成人工半合成的完整tRNA_y~(Ala),具有接受[~3H]-丙氨酸和将[~3H]-丙氨酸转移到蛋白质中的生物活力。     

大豆花叶病毒NIb基因的cDNA克隆和序列分析

以大豆花叶病毒北京分离株(SMV-BJ)RNA为模板,随机六聚核苷酸为引物,合成cDNA。根据SMV-BJ外壳蛋白基因序列和国外已报道的SMV,WMV-Ⅱ的有关序列,设计寡聚核苷酸引物。通过聚合酶连锁反应,得到了SMV NIb基因的全长cDNA克隆,并测定了其全序列。所测SMV NIb基因序列与WMV-Ⅱ(USA)株系比较,其核苷酸同源性达80.3％,由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性达到91.3％。综合SMV-BJ基因组3′端非编码区、外壳蛋白基因和NIb基因的资料,我们认为:WMV-Ⅱ可能是SMV的一个西瓜株系。实验中发现一些含NIb基因的重组克隆在3′端区域有大的序列变异,并讨论了这种变异的原因。在完成基因拚接、改造的基础上,构建了SMV-BJ NIb基因的高等植物表达载体。     

特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒的Ribozyme的体外活性测定

本文报道根据Ribozyme的作用模式、设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯纺锤形块茎类病毒(PSTV)正链和负链RNA的Ribozyme基因。以转录的PSTV正链及负链RNA作为底物与转录的Ribozyme RNA一起保温检测Ribozyme的体外切割活性。实验结果表明,当在50℃保温时,特异性切割PSTV正链及负链的Ribozyme在体外具有相当高的特异性切割活性;并且当在25℃保温时,Ribozyme仍具有相当的切割活性。在此基础上,正试图将Ribozyme基因导入马铃薯植株以检测其体内活性。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及其植物表达载体的构建

从感病的萝卜叶片中得到芜菁花叶病毒(TuMV)的分离物,以oligo(dT)为引物,合成了其基因组RNA的互补DNA,并克隆到载体λ-ZAPⅡ中。通过单链cDNA探针杂交和DNA末端序列分析找出含有poly-A尾巴的阳性克隆。我们对一个含有1429个碱基插入片断的克隆进行了序列分析,根据芜菁花叶病毒外壳蛋白分子量的大小和马铃薯Y病毒组蛋白质加工位点氨基酸序列的保守性,确定了外壳蛋白基因的5′末端。利用PCR方法对其5′末端进行改造,加进起始密码ATG和两个限制性内切酶位点。通过基因重组操作,将该基因插入到双元载体pBI121的衍生物pBIN437中,得到芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体。     

小麦丛矮病毒的L,NS和N蛋白在病毒RNA的体外转录过程中的作用

本文对小麦丛矮病毒核衣壳(WRSV-NP)进行分级解聚并通过甘油垫子超离心,可分别得到L蛋白,NS-N-RNA复合物,NS蛋白和N-RNA复合物等4个病毒组份。这些组份在单独测定时都不表现RNA聚合酶活力;在进行不同重组以后发现,只有当L,NS和N-RNA复合物同时共存时才能进行体外转录。实验还表明,这三种蛋白质与WRSV-RNA的结合力依次为N>>NS>L。根据结果,我们推测:L和NS蛋白可能共同构成RNA聚合酶复合物;而与病毒RNA紧密结合的N蛋白可能具有保持基因模板活力的功能。     

人组织型纤溶酶原激活剂表达调控及高效表达的研究——Ⅰ.t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的调控

运用分子剪切技术构建了含不同长度3′端非翻译区(3′-UTR)的t-PAcDNA克隆,体外转录的mRNA在兔网织红细胞裂解物中翻译和COS-7细胞中表达的结果表明t-PA mRNA 3′-UTR序列对其表达有明显抑制作用,3′-UTR缺失使t-PA表达水平提高3—8倍。进一步研究表明,t-PA mRNA 3′-UTR对其表达的抑制是由3′末端长约200nt的富含AU序列所致。RNA稳定性试验证实这段富含AU的序列使t-PA mRNA稳定性下降3倍以上;将该序列插入荧光素酶(Luc)基因3′-UTR,使Luc的表达水平明显降低。分析了该序列调节t-PA表达的可能机理,提出了调控的模式。     

AB_2型星形杂臂偶氮液晶聚合物的合成及表征

通过原子转移自由基聚合(ATRP)与ATRP衍生物化学修饰结合的方法,合成了一系列AB2型星形杂臂偶氮液晶聚合物.其中,A为聚苯乙烯,B为聚6-[4-(4′-甲氧基苯基)偶氮苯氧基己酯](PMMAZO).合成分三步进行.首先,以ATRP方法得到ω-溴聚苯乙烯活性链PS(Br).然后对PS(Br)进行化学改性,得到带两个末端溴原子的聚苯乙烯活性链PS(Br)2·最后,以PS(Br)2作为双官能团大分子引发剂,引发6-[4-(4′-甲氧基苯基)偶氮苯氧基]己酯(MMAZO)发生ATRP聚合,得到星形杂臂PS(PMMAZO)2聚合物.进一步对聚合产物进行了GPC和1H-NMR分析.结果表明合成产物是预期的星形杂臂聚合物,产物分子量可控且分子量分布狭窄.同时,以DSC和POM表征了星形杂臂聚合物的液晶性.     

双(1,4-二酰基氨基硫脲)化合物的合成

酰氨基硫脲及其相关化合物通常具有广泛的生物活性 ,如抗菌[1～ 3] ,抑制神经紧张[4] ,治疗血糖过低[5] ,植物生长调节[6～ 9] 等。迄今为止 ,鲜有关于双 (1 ,4 二酰基氨基硫脲 )合成的报道。为了考查该类化合物的生物活性 ,我们设计合成了一系列双 (1 ,4 二酰基氨基硫脲 )化合物 ,以下图所示的两条合成路线合成了该类化合物 :二酰氯 (1 )、异硫腈酸酰酯 (2 )等中间体可不经进一步纯化直接用于下一步反应。所生成的产物 3ａ 3ｆ、3′ｄ 3′ｇ经ＤＭＦ Ｈ2 Ｏ ＥｔＯＨ重结晶 ,产率达 81 %～ 98%。在合成化合物 (1 )时 ,对于一些用ＳＯＣｌ2 …     

N-(1, 3, 4-噻二唑-2-基)-N′-芳酰基脲的合成及其生物活性

N-(1;3;4-噻二唑-2-基)-N′-芳酰基脲的合成及其生物活性;噻二唑;芳酰基脲;合成;生物活性;植物生长调节剂     

2-[-1′-(4′-甲基-3′-戊烯基)]-2-甲基苯并呋喃的合成研究

许多天然产物(如黄酮、香豆素、苯丙素)分子结构中含有2-[-1′-(4′-甲基-3′-戊烯基)]-2-甲基苯并呋喃(1a)和1b的结构单元,如,具有抗肿瘤生物活性的Sanggenol L 4和Kuwanol 5[1].因此寻找1a和1b便利有效的合成方法具有重要的合成价值.我们采用2,4,6-三羟基苯乙酮(2a)[或2,4-二羟基苯乙酮(2b)]为原料,与柠檬醛3在有机碱(吡啶、三乙胺、N,N-二乙基苯胺)的作用下,一步反应以较好的收率40%～70%分别获得1a和1b结构单元.     

5-(3′-芳基-5′-噁唑烷酮基甲氧基)-3(2H)哒嗪酮类化合物的合成及生物活性

5-(3′-芳基-5′-噁唑烷酮基甲氧基)-3(2H)哒嗪酮类化合物的合成及生物活性;芳基噁唑烷酮基甲氧基哒嗪酮;合成;生物活性     

转基因水稻植株再生及外源人α-干扰素cDNA的表达

本文使用转化脂介导转化法(Lipofectin-mediated transformation)成功地将含有人α-干扰素(Hu-α-IFN)cDNA以及与其连锁的新霉素磷酸转移酶(Npt-Ⅱ)基因的E. coli质粒pIG3031导入到水稻(indica type rice)的原生质体内,并由此获得转化愈伤组织。基于Npt-Ⅱ酶活性的测定结果表明转化频率高达10％。筛选出的转化愈伤组织在分化培养基上再生出了完整的籼稻转基因植株。Southern杂交分析证明,外源Hu-α-IFN cDNA己整合到水稻基因组内;RNA条带杂交结果显示,外源Hu-α-IFN cDNA在T-DNA转录子1启动子(P1′)的控制下,在转化水稻细胞中有效地进行了转录;体外生物活性检测表明,转化植株组织抽提物中含有干扰素特有的抗病毒活性,说明外源Hu-α-IFN cDNA可在水稻细胞内正确表达。