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现有知识所知道的锤头状Ribozyme结构中,剪切是在特殊位点的3′侧发生,我们将含GTΨ的酵母丙氨酸tRNA 3′半分子(40聚)作为底物,按Haseloff-Gerlach锤头结构模型设计了一个38聚的Ribozyme分子。在镁离子存在的条件下,GTΨ的3′侧发生预期的体外剪切反应。反应的米氏动力学参数为:K_m:6.7μmol/L,k_(cat):3.4×10~(-3)/min。与此同时,合成了一个17聚的底物类似物,仅以GUU代替上述的GTΨ序列。恒态动力学分析表明,两底物的K_m值大致相同,但k_(cat)值相差达294倍。实验表明,修饰核苷酸Ψ可以是Ribozyme锤头结构中的剪切位点,但具有很低的k_(cat)。 相似文献
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本试验结果表明:1.2′-5′三腺苷酸(2′-5′P_3A_3)有激活多种来源(包括人)巨噬细胞的吞噬作用,说明2′-5′P_3A_3对巨噬细胞的激活作用具有普遍意义。2.甲胎蛋白(AFP)能抑制巨噬细胞的吞噬功能,可能对肝癌的发生有一定的作用。本工作证实2′-5′P_3A_3能抵消AFP对巨噬细胞的抑制作用。3.关于2′-5′P_3A_3生物功能的研究,过去都要用CaCl_2等方法将它引入细胞,这对临床应用是不实际的。本文不使用CaC国_2等方法,2′-5′P_3A_3即能激活巨噬细胞。 相似文献
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本文报告用T_4RNA连接酶将相应于酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))3′-半分子(36—76)的三个寡核昔酸大片段——10(36—45)(Ⅰ),12(46—57)(Ⅱ)和19p(58—76)(Ⅲ)——从3′-端向5′-端延伸逐个连接合成了这个tRNA的3′-半分子(36—76)。首先在供受体配比为1:1.5的情况下,采取三步连续反应,即19p(Ⅲ)的5′-磷酸化,然后与12(Ⅱ)的连接和连接反应产物的5′-磷酸化等反应,一次制备分离的方法,以70%的总得率合成了5′-磷酸化的三十一核苷酸(46—76)(Ⅳ)。然后,以(Ⅳ)作为下一步反应的供体和三倍量的10(Ⅰ)连接,以67%的产率合成了具有四十一核苷酸的tRNA_y~(Ala)的3′-半分子(36—76)(Ⅴ)。将这个合成的3′-半分子,5′-磷酸化以后,与天然的5′-半分子连接,人工半合成了tRNA_y~(Ala)整分子,经生物活力测定,这个人工半合成的tRNA_y~(Ala)具有接受[~3H]-丙氨酸、并能将接受的丙氨酸转移到蛋白质分子中去的生物活力。 相似文献
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_(ppp)A_(2'p),'A_(2'p,)'A(2'-5'P_3A_3) activates macrophages and increases the phagocytosis of macrophages from different species including human beings. This indicates that the activation of macrophages may be a general action of 2'-5'P_3A_3. This discovery broadens the effect of 2'-5'P_3A_3 beyond the antiviral field.α-Feto-protein (AFP) inhibits the phagocytosis of macrophages and may be involved in the development of hepatoma. Data presented here show that 2'-5'P_3A_3 can antagonize this suppressive effect of AFP.Methods used so far for introducing 2'-5'P_3A_3 into the cells were made with the aid of CaCl_2, etc. under conditions which may not be the same as those used clinically. It was found that 2'-5'P_3A_3 can develop its biological effect without the aid of CaCl_2, etc. 相似文献
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在体外系统中,T 7-RNA聚合酶转录编码酵母丙氨酸tRNA及其半分子的DNA,获得不含修饰核苷酸的酵母丙氨酸tRNA及其5’半分子(1-35位核苷酸)和3'半分子(37-75位核苷酸).在T4-RNA连接酶的催化下,不含修饰核苷酸的5'半分子(1-35位核苷酸)和3'半分子(37-75位核苷酸)分别与天然的3'半分子(36-75位核苷酸)和5'半分子(1-36位核苷酸)连接成tRNA类似物.用以上方法得到了酵母丙氨酸tRNA的3个类似物:(1)tRNA的5'半分子不含修饰核苷酸;(2)tRNA的3'半分子不含修饰核苷酸;(3)整个tRNA分子不含有修饰核苷酸.在鼠肝氨酰tRNA合成酶系统中测定tRNA接受丙氨酸的活力,在兔网质无细胞蛋白质合成系统中测定tRNA将丙氨酸参入蛋白质的活力.结果是:5'半分子不含修饰核苷酸者,其接受丙氨酸的活力降低52%,而参入丙氨酸的活力基本不变;3'半分子不含修饰核苷酸者,其接受丙氨酸的活力降低79%,参入活力降低57%;整个分子不含修饰核苷酸者接受丙氨酸的活力降低85%,参入活力降低47%.这些结果说明修饰核苷酸,尤其是3'半分子的修饰核苷酸与tRNA的接受活力和参入活力间有密切的关系. 相似文献
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聚合酶链反应用于高效的基因改造 总被引:1,自引:0,他引:1
本文报道利用近年来发展起来的基因体外扩增技术——聚合酶链反应(PCR)进行高效的基因定向改造的结果。在构建新的EcoRI基因表达质粒时,为了在EcoRⅠ基因SD序列前改变一个碱基引入SalⅠ切点以缺失其启动子,同时将Glul44改造成Lys,我们回收分离pER101的1.5kb SalⅠ/PatⅠ片段作为模板,合成各带一个错配的两个25聚DNA片段作为扩增引物,利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增,结果经过30个循环,从约0.05μg模板DNA得到约10μg的0.49kbDNA。根据理论计算,扩增产物中突变片段占99%以上。用SalⅠ/BglⅠ酶切克隆入pUCl9 SalⅡ/BamHI,任意取两个重组子进行序列分析结果表明都发生了预期的突变。扩增产物已被克隆入pER304,使得EcoRl(Lys-144)基因置于PL下游以实现其控制的高表达。 相似文献
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A thorough study on the reaction of 32_pN_p with 14 dinucleoside monophosphates including U_pI and C_p m~1I has been reported. The 10μl reaction mixture containing 100mM Tris (pH8.3), 40mMMgCl_2, 6.6mM DIT, bovine serum albumin (20μg/ml), 1mM ATP, 0.25mM dinucleoside monophos-phate, 0.05mM 32_pN_p and T_4 RNA ligase was incubated for 24 hr at 5--10℃ (or 2 hr at 37℃).The joining yields depend on the reaction temperature, the donor species and the base compositionof acceptors,_pC_p is the best donor. At 5--10℃, it can join in all 14 dinucleoside monophosphateswith yields ranging from 20% to 80%. The next one is _pA_p, but the yields are comparatively low.Both _pG_p and p_U_p are poor donors, which react with some dinucleoside monophosphates to give ayield of only a few percent, and sometimes no product could be obtained whatsoever. 相似文献