酶解法制备方格星虫多肽及其抗氧化作用研究

采用木瓜蛋白酶酶解制备方格星虫多肽,通过单因素实验研究了加酶量、酶解温度、酶解时间、酶解pH值和料液比等因素对羟自由基清除率的影响。通过正交试验确定了木瓜蛋白酶对方格星虫最佳的酶解工艺条件为:加酶量300 U/g,酶解温度50℃,酶解时间60 min,酶解液pH值7.0,料水比1∶3。在此条件下酶解方格星虫获得多肽的羟自由基清除率为95.42%,表明方格星虫酶解物具有较明显的抗氧化能力。由高效体积排阻色谱(HPSEC)法测得方格星虫多肽的分子量为5868。     

方格星虫多肽的酶解法制备工艺优化与抗氧化作用研究

分别采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等8种蛋白酶酶解方格星虫制备方格星虫多肽,通过测定酶的活力和羟自由基清除率,确定以木瓜蛋白酶作为方格星虫多肽的酶解最适酶。通过单因素实验研究了加酶量、酶解温度、酶解时间、酶解pH和料水比等因素对羟自由基清除率的影响,并通过正交试验确定了木瓜蛋白酶对方格星虫优化的酶解工艺为:加酶量300U/g,酶解温度50℃,酶解时间60min,酶解液pH7.0,由此条件酶解,获得的羟自由基清除率为95.42%。结果表明,方格星虫多肽具有很强的清除自由基的能力。     

马鲛鱼抗氧化肽的纳流液相色谱法分离与筛选

在海洋天然产物中,马鲛鱼是一种重要的高活性抗氧化肽生物源,具有极高的加工附加值。由于鱼体组织的复杂性,活性抗氧化肽成分的提取和筛选对样品制备和分离技术提出了挑战。使用不同蛋白酶对鱼体组织进行酶解时,所获得的活性肽结构及功能活性会有显著的差别。为了获得高活性的抗氧化肽,该研究分别考察了风味蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶5种蛋白酶的酶解效果。以二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、羟自由基(·OH)清除率和水解度(DH)为指标,筛选最优水解酶。结果表明,胰蛋白酶酶解液清除DPPH·和·OH能力最强,清除率分别达到88.93%±0.82%和53.09%±0.73%。在单因素试验的基础上,以DPPH·清除率为响应值,以加酶量、酶解温度和时间为函数,进行了三因素三水平响应面试验,获得水解度23.66%、DPPH·清除率93.78%以及·OH清除率62.59%的最优制备条件。纳流液相色谱具有低样品量、低溶剂消耗和高效等优势。为筛选出适合于马鲛鱼内脏抗氧化肽分离分析的固定相,该研究使用1∶1000分流比的纳流液相平台,分别使用反相C18柱(15 cm×100 μm, 5 μm, 30 nm)和强阳离子交换柱(15 cm×100 μm, 5 μm, 100 nm)进行分离,收集、冻干并评测了各组分的抗氧化能力。结果表明,强阳离子交换固定相更适合于马鲛鱼内脏抗氧化肽的分离纯化,并筛选出1个强活性抗氧化肽组分。该组分DPPH·清除力的半抑制浓度(IC₅₀)为0.672±0.051 mg/mL,与纯化前相比提高了13.6倍。该研究报道了纳流液相色谱在海洋天然产物源抗氧化肽分离分析中的应用,并证明了其在活性抗氧化肽成分筛选中的有效性和良好的应用前景。     

酶解鹿茸肽的制备、纯化及抗氧化活性

利用一种工业用碱性蛋白酶对新鲜梅花鹿鹿茸进行水解制备生物活性肽。首先,考察了酶用量、底物浓度和反应时间对水解反应的影响,确定了最佳水解条件为酶浓度1：150,底物浓度1：13,水解时间60 min。其次,利用硫酸胺分级沉淀法制备了鹿茸多肽粗提液,同时采用缓冲液保护其活性,再经Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离纯化,得到了具有最强抗氧化活性的鹿茸肽组分（VAP-B）。最后,利用制备型高效液相色谱柱对VAP-B进一步纯化,得到了分子量在800以内的小肽活性组分（VAP-B1）,其蛋白含量为70.45%。在此基础上,对小肽活性组分VAP-B1进行了理化性质分析,检测其抗氧化活性,包括清除超氧阴离子,羟自由基以及抗脂质过氧化的能力和还原能力。实验结果表明,鹿茸肽VAP-B1浓度为20mg/ml时,对邻苯三酚自氧化的抑制率达到91.9%,有明显的清除超氧阴离子的作用;浓度为10mg/ml时,对羟基自由基的清除作用达到100%,且在一定的浓度范围内呈剂量依赖关系。此外,鹿茸肽VAP-B1具有一定的防止脂质过氧化和还原力作用。     

4种黄酮小分子对DPPH自由基的清除作用及构效关系研究

通过紫外可见光谱测定了4种黄酮小分子芦丁、牡荆素、山奈素、金丝桃苷对DPPH自由基的清除率、稳定性及半抑制浓度(IC50),并以常用的天然抗氧化剂抗坏血酸作为对照,考察了其抗氧化效果,探讨了黄酮类化合物的抗氧化性与结构的关系。结果表明：不同的抗氧化剂清除DPPH自由基达到平衡的时间不同,芦丁所需时间最长。4种黄酮小分子及抗坏血酸均对DPPH自由基有清除效果,并存在一定的量效关系。对DPPH自由基的清除能力从大到小依次为金丝桃苷、抗坏血酸、芦丁、山奈素、牡荆素。结构分析表明,B环邻二酚羟基是黄酮类化合物抗氧化所必需的基团,其羟甲基化及A环羟基糖苷化不利于黄酮类化合物的抗氧化活性。而C环3-OH的糖苷化对抗氧化活性有利,且单糖苷优于双糖苷。     

洗参水美白与抗氧化活性及其皂苷类成分分析

对洗参水冻干粉样品美白、抗氧化活性及其皂苷成分进行分析。通过采用生化酶学法测定酪氨酸酶抑制率探究洗参水冻干粉样品的美白活性,采用水杨酸法测定羟自由基(Hydroxyl radical,·OH)清除率和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH自由基)清除率探究洗参水冻干粉样品抗氧化活性,同时利用高分离度快速液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱(RRLC-Q-TOF MS/MS)法对洗参水冻干粉样品中的皂苷类成分进行分析,共鉴别出16种人参皂苷。结果表明,洗参水冻干粉样品中总皂苷含量为1.64 g/100 g;该样品对酪氨酸酶活性具有抑制作用,当质量浓度为57.82 mg/mL时,样品对酪氨酸酶抑制率为50.50%;同时具有一定的抗氧化活性,当样品质量浓度为38.03 mg/mL时,对·OH的抑制率达到50.30%;当样品质量浓度为52.04 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率为50.10%。综上,洗参水作为人参初加工被废弃的副产物,存量较大,是值得再利用开发的美白、抗氧化、防衰老类产品的原料。     

质谱技术研究海兔大脑神经节超微量多肽内切酶和酸性多肽酶解产物

采用ESI-Q-TOF质谱分析了由27个氨基酸残基组成的酸性多肽(AP)的一级结构.选用RP-HPLC和MALDI-TOF质谱非在线技术分离与鉴定海兔大脑神经节(CG)多肽与蛋白质的组成与分布,发现CG中含有AP酶解的二聚体短肽.这些短肽序列分别为2(NKDEEQRELLKAISNLL)、2(NKDEEQRELLKAISNL)、2(SGVSLLTSNKDEEQREL)和2(LTSNKDEEQRE LL),均以L-R(氨基酸残基)方式断裂.以AP为探针,结合MALDI-TOF质谱分析技术,发现CG中含有超微量的L-R多肽内切酶,其分子量为78218.25Da.本研究中的分析方法也适合于研究其他生物体内超微量多肽及多肽酶分布与功能.     

核桃蛋白酶解物的制备及抗氧化活性

采用碱性蛋白酶对核桃蛋白进行酶解, 检测了所得酶解物的抗氧化能力, 包括对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和羟基自由基(·OH)的清除能力; 利用Sephadex G-25 凝胶层析柱和反相柱对核桃蛋白酶解物进行分离纯化; 采用液相色谱-质谱(LC-ESI-Q-TOF)联用方法测得抗氧化能力最强的多肽的序列为Ala-Gly-Gly-Ala, 其还原力和还原型谷胱甘肽相当.     

反相高效液相色谱法分离制备蜂毒肽类似物

应用高效制备液相色谱法，对5种合成的蜂毒肽类似物分离制备。当用极性较强的洗脱液做流动相时，主峰的保留时间短，且主峰和前后的杂质峰不能很好的分开；随着洗脱液极性减弱至某一值时，主峰和杂质峰的保留时间均向后延长，且时间间隔加大，可以成功地对多肽样品进行分离制备。有多肽分子中各氨基酸保留常数加和值的方法可以预测不同多肽的保留时间，为选择分离纯化多肽所需的流动相提供了参考作用。经半制备分离纯化后的产物用分析型RP－HPLC测定达到了很高的纯度，氨基酸分析结果表明得到了所需的肽段，可以用于下一步的研究工作。     

质谱技术研究海兔大脑神经节超微量多肽内切酶和酸性多肽酶解产物

采用ESI-Q-TOF质谱分析了南27个氨基酸残基组成的酸性多肽（AP）的一级结构。选用RP-HPLC和MALDI-TOF质谱非在线技术分离与鉴定海兔大脑神经节（CG）多肽与蛋白质的组成与分布，发现CG中含有AP酶解的二聚体短肽。这些短肽序列分别为2（NKDEEQRELLKAISNLL）、2（NKDEEQRELLKAISNL）、2（SGVSLLTSNKDEEQREL）和2（LTSNKDEEQRE LL），均以L-R（氨基酸残基）方式断裂。以AP为探针，结合MALDI-TOF质谱分析技术，发现CG中含有超微量的L-R多肽内切酶，其分子量为78218.25Da。本研究中的分析方法也适合于研究其他生物体内超微量多肽及多肽酶分布与功能。     

高效液相色谱分离纯化血管紧张素转换酶活性抑制肽

采用分步高效液相色谱法首次从菠菜核酮糖双磷酸羧化酶(英文缩写为Rubisco)的胃蛋白酶-胰酶复合酶水解产物中分离纯化了血管紧张素转换酶(ACE)活性抑制肽。水解产物经ODS柱分离得到活性组分,这些活性组分再依次经过氨基柱(PhA) 氰基柱(CN)和硝基苯乙基柱(NPE)4种色谱柱分离后,得到4种高度纯化的具有抑制ACE活性的多肽。经蛋白质序列自动分析仪测定,4种多肽的结构分别为MRWRD,MRW,IAYKPAG和LRIPVA。采用固相多肽合成法分别合成了这4种肽,并采用测定ACE活性抑制率的方法评价其     

反相高效液相色谱-电喷雾质谱法分析食源血管紧张素转换酶抑制肽

利用反相高效液相色谱/电喷雾离子阱质谱法,直接分析从牦牛乳酪蛋白中酶水解得到的血管紧张素转换酶抑制肽粗产物。RP-HPLC显示具有活性的多肽粗产物含有3个主要成分,质谱同步测定各组分的分子量(m/z)分别为815.2,1680.1,962.2,然后选择[M H] 离子通过串联质谱(MS/MS)得到碎片离子,利用b离子和y离子互补的方法鉴定了多肽序列。三条肽分别为Leu-Pro-Tyr-Tyr,Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Gln,Phe-Leu-Pro-Pro-Tyr-Tyr。结果显示,所获得的多肽序列与牛乳酪蛋白一级结构中相应肽段的序列一致。     

基于准确质量数对肽族[γ-(Glu-Cys)_n-Gly]色谱-质谱分析研究

基于多肽γ-(Glu-Cys)n-Gly系列化合物合成的递增规律性,利用Trap-MS离子筛选功能实现多肽的定性定量分析。首先利用多肽分子中巯基与单溴二胺(mBBr)发生缩合反应,生成具有荧光信号的多肽衍生物,比较衍生化前后分子量发现多肽与mBBr的反应比例为1∶1,荧光信号强度1周内稳定性较好。优化了色谱分离及质谱条件,建立了HPLC-Trap-MS定性定量分析方法,离子提取结果显示:多肽化合物基于其理论分子量定性分析准确快速,化合物分离效果明显,PC_2,PC_3,PC_4,PC_5和PC_6系列标准溶液的线性范围宽,相关系数(r)大于0.999,各化合物的方法检出限分别为0.13,0.02,0.17,0.39,0.82 mg/L,化合物的回收率为89.0%~99.5%;相对标准偏差(RSD)小于3.5%;多肽化合物的荧光标记和Trap-MS筛选可实现荧光与质谱双重检测器的定量分析,该方法可对多肽系列化合物进行快速、准确的测定。检测了Zn和Cd诱导后藻体中多肽的含量变化,结果显示藻体中的多肽对金属具有诱导响应,其中小分子肽变化相对明显,随着碳链的增加,多肽对重金属的诱导响应滞后。     

基于响应面法的螺旋藻多肽制备工艺的研究

应用响应面分析法优化木瓜蛋白酶酶解制备螺旋藻多肽的工艺条件。根据中心组合试验设计的原理,在单因素试验的基础上,以多肽得率为响应值,利用响应面法对影响螺旋藻蛋白酶解反应的各种影响因素如温度、pH、酶解时间和加酶量进行了系统研究,得到最佳工艺条件为:反应温度55℃、pH值7、酶底比1.6%、酶解2 h,制得多肽含量得率可达20.61%,与模型预测的肽含量21.25%较接近。     

As(Ⅲ)胁迫对小球藻生化指标的影响及其耐受性机制研究

本研究通过测定不同浓度As(Ⅲ)作用下小球藻叶绿素a、可溶性蛋白、丙二醛(MDA)等生化指标，结合藻细胞SEM-EDS、TEM形貌分析和MOE分子模拟，探究As(Ⅲ)对小球藻生长的抑制作用；通过评估藻细胞内抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性，揭示小球藻应对As(Ⅲ)胁迫的反应机制。结果显示：在高浓度As(Ⅲ)(300、600mg/L,6天)胁迫下，叶绿素a含量仅为对照组的40%,可溶性蛋白含量与对照组相当，MDA含量较第4天降低40%。SEM、TEM显示，小球藻在As(Ⅲ)作用下细胞表面皱缩、细胞器溶解、藻体破裂。MOE模拟表明，小球藻内大分子通过氢键与As(Ⅲ)结合，从而提高藻细胞耐受能力。研究表明小球藻对As(Ⅲ)具有一定的耐受性，但高浓度As(Ⅲ)会导致藻体死亡。     

Enterobacter Cloacae Z0206细菌胞外富硒多糖的抗氧化活性

利用产多糖菌Enterobacter cloacae Z0206(E.cloacaeZ0206)的深层发酵法制备了E.cloacae Z0206细菌富硒多糖;测定了其还原能力和清除1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)自由基、超氧阴离子及羟自由基的能力.结果表明,通过深层富硒发酵、醇沉离心等制备富硒多糖SEPS的产量为9.28g/L,富硒量为2.314mg/g;E.cloacae Z0206富硒多糖对DPPH自由基和羟自由基具有较好的清除作用,在浓度为5g/L时对DPPH自由基和羟自由基的清除率分别为80.35%和84.26%,并具有较强的还原能力,但其对超氧阴离子自由基的清除能力较差.     

水解珍珠体外抗氧化活性的研究

本文以L-抗坏血酸(VC)为对照组,测定水解珍珠对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS自由基的清除能力,研究水解珍珠的体外抗氧化活性。结果表明:水解珍珠对DPPH和ABTS自由基具有较强的清除能力,IC_(50)分别为0.07%和0.14%;而对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力相对较弱,IC_(50)分别为12.60%和7.65%;其IC_(50)均低于VC,差异具有统计学意义(p0.05)。另外,水解珍珠对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS自由基的清除率都随着体积分数的增大而显著增加(p0.05)。水解珍珠具备较高的抗氧化能力,可为珍珠资源的开发利用提供理论依据。     

鹿茸寡肽的制备及其促成骨细胞的增殖作用

从梅花鹿鹿茸中提取了天然鹿茸总多肽(VATP). 在进一步分离纯化的过程中, 筛选出具有促进成骨细胞增殖的高活性肽组分(VAP-B), 并通过制备型HPLC对其纯化, 得到了分子量分布约为200~600的小肽活性组分(VAP-B2). 细胞周期分析结果表明, 鹿茸肽VAP-B2组分促进了人成骨肉瘤细胞OS-732的周期转化, 使其细胞周期S期细胞指数明显增加, 即表现为S期DNA含量明显提高. 碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果表明, 随着鹿茸肽VAP-B2剂量的增加, ALP的活性明显增加. 这与成骨细胞增殖分化及成熟过程中, 细胞的周期性变化和骨形成标志物碱性磷酸酶水平的明显增高相符.     

紫花苜蓿叶蛋白抗氧化产物的制备及其抗氧化活性的研究

以紫花苜蓿叶蛋白为原料,葡萄糖为改性物,以总还原能力,DPPH·清除率与HO·清除率为指标,湿热美拉德反应为改性方法,在单因素试验基础下探究反应体系pH值、反应底物配比、温度及时间对紫花苜蓿叶蛋白抗氧化活性的影响。结果表明在pH=9,底物配比(m紫花苜蓿叶蛋白∶m葡萄糖)为2∶1,反应温度为80℃,反应时间为60 min时美拉德产物(改性之后的紫花苜蓿叶蛋白)的抗氧化活性最显著。在最优单因素条件下未改性的紫花苜蓿叶蛋白总还原能力为0.84,DPPH·清除率为1.45%,HO·清除率为2.18%。在最优单因素条件下改性之后的紫花苜蓿叶蛋白总还原能力达到1.10,DPPH·清除率达到75.10%,HO·清除率达到39.70%,与未改性的蛋白相比总还原能力提高了0.31,DPPH·清除率提高了50.80%,HO·清除率提高了17.21%。通过测定在不同单因素条件下美拉德产物的褐变程度、中间产物、接枝度等,表明紫花苜蓿叶蛋白与葡萄糖之间发生了美拉德反应。     

酶法获得的多肽库用于新型手性固定相的制备

采用胰蛋白酶酶解牛血清白蛋白,将制备的酶解液超滤,得到相对分子质量小于6000的小分子多肽库。应用羰基咪唑法将该多肽库键合至多孔硅胶,得到一种新型手性固定相。应用该新型手性固定相成功地拆分了两种氨基酸对映体。