家蚕核多角体病毒基因库

本文报道家蚕核多角体病毒基因组DNA经限制性内切酶SalI酶解,琼脂糖凝胶电泳分离,得0.70至 10.0kb大小不同的29种片段.所得 DNA片段与 SalI酶解之质粒pBR 322 DNA进行体外重组后,经转化大肠杆菌 HB 101菌株,获得带重组质粒克隆株.根据重组质粒DNA 中SalI酶插八片段的分子量、Southern法DNA杂交及多种限制性内切酶酶切点等方法鉴定,证明已将家蚕核多角体病毒DNA的24种不同大小的片段克隆在质粒 pBR 322 中.克隆的 DNA片段总长度占病毒基因组DNA的百分之八十。     

具有原核基因启动子活性的家蚕核多角体病毒的DNA片段

本文利用大肠杆菌启动子克隆用质粒pHE5,克隆和分离了家蚕核多角体病毒基因组的8种HindⅢ酶解DNA片段和一种SalⅠ酶解DNA片段。我们发现它们都具有指导抗四环素基因表达的启动子活性。测定了含有这些DNA片段的重组质粒的菌株抗四环素能力。其中最高的可以抗四环素至每毫升约30μg。我们分析了一个DNA片段的部分核苷酸顺序。发现它具有与原核基因启动子极相似的顺序结构。     

Azorhizobium caulinodans ORS571结瘤位点5(nod locus 5)的鉴定

用克隆的含A.caulinodans ORS 571 nodABC基因启动子区域(P_1)的800bp AccⅠ-pUC Ⅱ DNA做探针,在染色体上探测到另一个与P_1同源的8.4kb DNA片段,从ORS571 pLAFR1基因文库中分离到带有该片段的克隆子pRG90,8.4 kb DNA的内切酶图谱分析及DNADNA杂交实验表明同源区(P_2)位于450bp SmaⅠ-SphⅠ片段内。用Ω因子对8.4 kb DNA进行缺失插入突变,鉴定出一个使S.rostrata结瘤延迟的突变株ORS571-5。该突变株结瘤延迟的表型可由pRK84质粒(nod locus 5)互补。     

聚合酶链反应用于高效的基因改造

本文报道利用近年来发展起来的基因体外扩增技术——聚合酶链反应(PCR)进行高效的基因定向改造的结果。在构建新的EcoRI基因表达质粒时,为了在EcoRⅠ基因SD序列前改变一个碱基引入SalⅠ切点以缺失其启动子,同时将Glul44改造成Lys,我们回收分离pER101的1.5kb SalⅠ/PatⅠ片段作为模板,合成各带一个错配的两个25聚DNA片段作为扩增引物,利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增,结果经过30个循环,从约0.05μg模板DNA得到约10μg的0.49kbDNA。根据理论计算,扩增产物中突变片段占99％以上。用SalⅠ/BglⅠ酶切克隆入pUCl9 SalⅡ/BamHI,任意取两个重组子进行序列分析结果表明都发生了预期的突变。扩增产物已被克隆入pER304,使得EcoRl(Lys-144)基因置于PL下游以实现其控制的高表达。     

亮-脑啡肽基因的合成

本文报道亮-脑啡肤基因的另一个合成途径。合成的基因,26个碱基对,是按照亮-脑啡肽的氨基酸顺序设计的。为了能够插入pBR 322质粒,基因带有EcoRI和BamHI限制性内切酶的单链粘性末端。化学合成的4个片段,8、9、17及18核苷酸,采用改良的三酯法。这些片段都具有正确的结构,最后在T_4-DNA连接酶的作用下,一步装配成脑啡肽基因。产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,具有正确的连接点。     

一个带有新的Hind Ⅲ切点的HBVadr基因组克隆株

本文报道利用HBVadr DNA的Hind Ⅲ切点,将HBV DNA切开,插进pBR322的Hind Ⅲ位点,获得12株带HBVadr基因组的克隆株。限制性酶切分析,发现pADR-H1虽然也只有一个Hind Ⅲ切点,但它在基因组中的位置与pADR-1不同。pADR-1的HBV DNA中,其Hind Ⅲ-Bam HI片段的大小为315 bp,而pADR-H1中的相应片段只有82bp。序列分析表明,前者82 bp处的一段AAGTTT结构,在pADR-H1中变为AAGCTT而成了Hind Ⅲ识别位点。此外,限制性内切酶AvaⅠ,HincⅡ,HpaⅠ和SphⅠ对二克隆株的作用情况也有差别。本文探讨了这些差别的意义。     

家蚕和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒P10基因的研究

从AcMNPV基因组DNA中克隆筛选得到含P10基因的EcoR I-P片段,以此作为探针克隆得到BmNPV P10基因片段,测定了其全核苷酸序列。PCR点突变BmNPV P10基因启始密码子ATG区,ATG突变的同时形成一个Bgl Ⅱ酶切位点,突变后的启动子及其5′端作为5′端交换臂和AcMNPV的P10基因3′端作为3′端交换臂构建成一个非融合通用转移载体pBmAcPV1.该载体可以在Sf细胞中和野生型AcMNPV DNA共转染重组表达外源基因,也可以在Bm细胞中和野生型BmNPV DNA重组表达外源基因。CAT基因在BmNPV P10 ATG突变后的启动子的控制下在家蚕细胞中得到高效表达     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及其植物表达载体的构建

从感病的萝卜叶片中得到芜菁花叶病毒(TuMV)的分离物,以oligo(dT)为引物,合成了其基因组RNA的互补DNA,并克隆到载体λ-ZAPⅡ中。通过单链cDNA探针杂交和DNA末端序列分析找出含有poly-A尾巴的阳性克隆。我们对一个含有1429个碱基插入片断的克隆进行了序列分析,根据芜菁花叶病毒外壳蛋白分子量的大小和马铃薯Y病毒组蛋白质加工位点氨基酸序列的保守性,确定了外壳蛋白基因的5′末端。利用PCR方法对其5′末端进行改造,加进起始密码ATG和两个限制性内切酶位点。通过基因重组操作,将该基因插入到双元载体pBI121的衍生物pBIN437中,得到芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体。     

胰泌素基因的化学合成和克隆

本文报道的内容为胰泌素基因的化学合成和克隆。胰泌素为一由2了个氨基酸组成的肠胃道多肽激素,该多肽合成基因的顺序由计算机辅助设计,共216个核苷酸碱基;合成基因选用酵母细胞偏爱的密码子,并在其中设置了一些便于今后用于基因改造、表达调控和产物分离所需的位点,排除了可能影响酶促连接反应的各种重复顺序;用化学法(固相磷酸三酯法和固相亚磷酸三酯法)合成了12个基因片段,长度为12寡聚核苷酸至24寡聚核苷酸,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化合成产物;利用T_4DNA连接酶组建完整的胰泌素基因,克隆于pWR 13质粒中,构建了一个含胰泌素基因的新质粒pWS 1。     

水稻腊质基因分子特性的研究

水稻腊质基因(Wx)负责胚乳与花粉粒中直链淀粉的合成。我们通过对限制图和DNA顺序有重叠的两个基因组克隆的分析,测定出了水稻Wx基因全长为5499bp的DNA顺序。比较水稻、玉米(Klsgen等)和大麦(Rohde等)中Wx基因的DNA顺序,弄清水稻Wx基因中存在13个内含子和14个外显子,通过微机对外显子顺序的翻译,得出了水稻Wx蛋白包括转运肽在内的609个氨基酸的排列顺序,并计算出它的分子量约为72kD。经比较,水稻Wx成熟蛋白的氨基酸顺序与玉米、大麦的没有明显地差异。但是,水稻Wx基因5′-上游区、3′-下游区和内含子区域的DNA顺序,以及Wx前体蛋白的转运肽区域的氨基酸顺序与玉米和大麦Wx基因的相应区域相比,它们之间的同源性却很低。     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

人原发性肝癌中的转甲状腺素蛋白(Transthyretin)基因

本文从人正常肝对原发性肝癌的递减式cDNA文库(Subtracting cDNA libra-ry)中筛选出pG8cDNA克隆.Northem杂交证明它在正常肝中高度转录,而在9例肝癌中转录严重受阻遏.9例肝癌DNA MspI酶切杂交信号提示,4例肝癌中该基因存在部分DNA片段的丢失.在另7对肝癌及癌旁组织样本中,有4例肝癌中该基因同样存在部分片段丢失.cDNA序列分析证明它与转甲状腺素蛋白(Transthyretin,TTR)基因的编码区全部同源.本文首次报道了在人肝癌中TTR基因转录严重受阻遏及在基因结构上可能存在丢失或缺陷,提示TTR基因可能是人肝癌中基因缺陷的一个标记或抗癌基因之一.     

北京鸭肝脏线粒体DNA的限制酶图谱

本文用五种限制性内切酶(EcoRⅠ,BamHⅠ,PstⅠ,BglⅠ和BglⅡ)建立了北京鸭肝脏线粒体DNA的内切酶图谱。这五种酶除BglⅡ不能切割鸭肝线粒体DNA外,EcoRⅠ,BamHⅠ,PstⅠ和BglⅠ在鸭肝线粒体DNA上分别有1,2,4和5个切割位点。应用电子显微镜及电泳法对鸭肝线粒体DNA的各种酶解片段进行测定后,推导出了此线粒体DNA的限制酶图谱。此外,还确定了D-环的位置及线粒体DNA复制的方向。     

一个链霉菌的质粒pHZ65及其载体的发展

FR-001和FR-005为农抗5102产生菌经原生质体融合后所产生的融合重组子,它们在形态及培养特征,抗菌活性及代谢产物方面均有明显差别。然而,它们则均含有一个DNA顺序同源,分子量大小均为20.1kb的质粒,命名为pHZ65。已用酶切分析法制做了这个质粒被限制内切酶BamHI,BclⅠ,BglⅡ,EcoRV,KpnⅠ,PstⅠ,SphⅠ,SstⅠ,XhoⅠ酶切共29个切点的详细图谱。在体外将携带了硫链丝菌素抗性基因tsr(可在链霉菌中表达)和氨苄青霉素抗性基因amp(可在大肠杆菌中表达)的大肠杆菌质粒pIJ2703插入到pHZ65的BclⅠ或BglⅠ位点,获得了4个既可转化链霉菌,又可转化大肠杆菌的双功能质粒pHZ200,pHZ201,pHZ206和pHZ207。将pHZ65的片段克隆到pIJ2703的BclⅠ位点所组建的一系列质粒在链霉菌中的复制能力揭示出pHZ65的必要复制功能区位于5个BglⅡ片段的2个连锁的片段(分别为4.44和0.52kb)之内。已从pHZ65衍生了一系列链霉菌——大肠杆菌的双功能载体。这类载体可以转化吸水链霉菌应城变种(FR-001和FR-005的融合亲本),而许多其它质粒载体则不能。     

花椰菜花叶病毒(新疆分离物)基因组的研究——病毒粒体DNA和克隆的病毒DNA的限制性内切酶图的测定

本文用混合酶解和一端以~(32)P标记的DNA的部分酶解测定了花椰菜花叶病毒新疆分离物(CaMV-XJ)基因组DNA的限制性内切酶图.它含有BglⅠ,SalⅠ,XhoⅠ的单一切点.BamHⅠ和HhaⅠ各有2个切点,EcoRⅠ有5个切点,HpaⅡ有7个切点,BglⅡ有8个切点,HaeⅢ有10个切点,HindⅢ有10个切点.在病毒粒体DNA和克隆的病毒DNA上这些酶的切点数目和位置是一样的.同其他大多数CaMV分离物一样,CaMV-XJ DNA上也有3个单链不连续区.从SalⅠ,XhoⅠ,EcoRⅠ,HhaⅠ的酶切情况看,CaMⅤ-XJ基因组的内切酶图谱与东德的CaMⅤ分离物BkMⅤ比较接近。     

毛细管电泳-激光诱导荧光检测分枝杆菌脱氧核糖核酸限制性内切酶谱

建立了毛细管电泳分离-激光诱导荧光检测（CE-LIFD）分析分枝杆菌脱氧核糖核酸（DNA）限制性内切酶谱的新方法。用聚合酶链反应(PCR)扩增分枝杆菌hsp65基因的长度为439 bp的片段,该扩增片段经限制性内切酶BstEⅡ和 HaeⅢ酶切后,分别用CE-LIFD装置和常规琼脂糖电泳（AGE）对比检测酶切片段。对PCR扩增片段的酶切样品的预处理和CE条件进行了优化,获得了8种分枝杆菌DNA的限制性内切酶谱图。 DNA片段相对迁移时间的相对标准偏差（RSD）≤3.6%。结果表明,CE的分离效能明显高于AGE,是研究DNA限制性内切酶谱的更有效的检测手段。     

枯草杆菌信号肽酶Ⅰ的识别序列特异性和信号肽在蛋白质分泌中的作用

本文采用重组体DNA技术使质粒pUB110的β-蛋白质的N-末端编码区与B.licheniformis的α-淀粉酶结构基因融合并产生了信号肽酶Ⅰ识别切割区,从而构建了带有β-信号肽的β AMY基因。该基因借助β-蛋白的可译读码和β-信号肽表达并分泌到胞外,分泌效率约为野生型的10％,通过对不同pβAMY质粒分泌能力的比较、限制性内切酶切点分析和β-信号肽介导下的胞外α-淀粉酶分子量的比较,in vivo证明了B.subtilis信号肽酶Ⅰ的特异识别切割序列为Ala—Ala—Ala Ala,结果还表明B.licheniformis α-淀粉酶在B.subtilis中的分泌作用符合翻译后加工模式。     

聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性和芯片生物分析技术用于台湾海峡常见石斑鱼和鲷鱼的品种鉴定

应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和芯片生物分析系统建立了台湾海峡常见石斑鱼和鲷鱼的分子生物学品种鉴定新方法。首先提取鱼的基因组脱氧核糖核酸(DNA)进行细胞色素b基因特定片段的PCR扩增,然后用DdeI、HaeIII和NlaIII 3种限制性内切酶进行酶切,在Agilent DNA 1000芯片上对酶切片段进行分离。该方法成功鉴定了台湾海峡常见的8种石斑鱼品种和5种鲷鱼品种,是一种快速、简便、有效的鱼类品种鉴定分析手段。     

人X染色体单拷贝序列的分离及鉴定的研究

本研究以人/鼠(CHO-K1)细胞总DNA为探针对人X染色体DNA文库进行了3轮筛选,单拷贝顺序的检出率为1.45％。其中DXFD52,71,73,75分别与一组含人X染色体及不含人X染色体的人/鼠杂种细胞DNA进行Southern杂交分析,确定DXFD52,71,73,75含人X染色体专性DNA顺序。采用染色体原位杂交的方法,将DXFD52精确定位于Xq12-q13。并对其进行了部分DNA顺序分析,结果证实DXFD52是人基因组中至今未被分离到的一个单拷贝DNA片段。继而对DXFD52进行限制性酶切图谱分析,并以其为探针在中国重庆地区正常人群中(随机个体38例、3个正常家系成员11例)进行了RFLP研究,发现该探针具有识别Hind Ⅲ,Bgl Ⅱ,Hinf Ⅰ的RFLP。     

半合成人肿瘤坏死因子cDNA的构建及其在大肠杆菌中的高表达

本文报道从人基因文库中分离淋巴毒素(LT)基因的同时,克隆了肿瘤坏死因子(TNF)基因,这两个基因相距1.2kb.TNF基因有4个外显子,第4外显子编码TNF成熟蛋白157个氨基酸中的140个.将第4外显子切出一部分,再人工合成编码其余氨基酸的DNA片段,两者连接构成重组的人TNF(rhTNF)cDNA,并克隆在大肠杆菌表达载体中成功地得到表达.5 l罐发酵得菌体约20g/l,以L929为靶细胞测定细胞毒活性为10~6-10~7单位/ml.高压液相色谱仪分离纯化rhTNF,冻干后得白色粉剂.测定了这种rhTNF的氨基端的10个氨基酸序列,证明与天然的人TNF完全相同.纯度约为95％.