乙型肝炎病毒表面抗原互补脱氧核糖核酸的分子克隆及检定

用特异性免疫沉淀法从一人肝癌细胞株(PLC/PRF/5)中浓集乙型肝炎表面抗原(HBsAg)信使核糖核酸(mRNA),制得互补脱氧核糖核酸(cDNA),进行克隆.用已克隆化的病毒探针进行原位杂交,检得一个含HBsAg cDNA的菌株.对它进行了限制性内切酶谱及核苦酸序列分析.该 HBsAg cDNA经~(32)P标记后与PLC/PRF/5细胞DNA和RNA分别进行分子杂交的结果,显示出整合入该宿主基因组中乙型肝炎病毒的拷贝至少有6个;含HBsAg特异序列的PNA有三种、本文对乙型肝炎病毒在原发性肝癌致癌基因中可能的作用进行了讨论。     

急性淋巴细胞白血病中T细胞受体γ基因V-J结合部顺序的研究

本文应用T细胞受体γ基因的V_γ和J_γ引物对一组急性淋巴细胞白血病(ALL)标本进行了DNA多聚酶链反应(PCR)的研究,应用不对称PCR以及DNA直接测序方法检测了18个中国人ALL细胞的TCR_γ基因V-J结合部区域(N顺序),在中国人ALL中首次证明了TCR_γ基因的N顺序确实是克隆特异的。进一步,依据已经测序的N顺序,我们合成了几个白血病克隆特异的寡核苷酸作为探针,对4例ALL进行了微小残余病变(MRD)的研究,显示该方法的灵敏度为0.1—0.01％。     

在中国人PAH基因中发现一种新的中性突变以及它在苯丙酮尿症产前诊断中的作用

本文在对一例中国PKU患者的PAH基因进行碱基顺序分析时发现了一种新的中性突变或顺序多态位点:11外显子第399密码子GTA(Val)→GTT(Val)。应用PCR体外扩增和寡核苷酸杂交技术对100个正常人和39个PKU患者进行分析,发现此顺序多态性在正常和异常PAH基因中的分布频率分别为0.005和0.090,存在一定的差异性。该顺序多态可作为一种“遗传标记”成功地对一例不能用RFLP连锁分析作完全诊断的PKU高危胎儿进行了产前诊断。     

阿达玛变换显微图象分析系统测定乳腺肿瘤细胞DNA含量

本文以吖啶橙为细胞DNA荧光探针, 探讨了影响阿棕玛显微图象分析仪定量分析细胞DNA时的细胞荧光强度以及影响人乳腺肿瘤细胞DNA定量分析结果准确性的几个因素, 结果表明: (1)乙醇是理想的固定剂, 醛类固定剂对细胞AO-DNA复合物的荧光有显著影响; (2)吖啶橙染色液中含Triton X-100时细胞荧光强芳明显增大; (3)吖啶橙的最佳荧光染色浓度为50μg/mL; (4)在分析乳腺肿瘤细胞DNA含量(倍性)时, 采用外标法(以人血涂片或淋巴结细胞涂上的淋巴细胞为标准二倍体细胞)或内标法(以乳腺肿瘤细胞涂片上的正常上皮细胞为标准二倍体细胞)均能得到较好的结果, 但后者更为可靠; (5)随机分析六十个以上肿瘤细胞, 可得到较好分析结果。     

阿达玛变换显微图象分析系统测定乳腺肿瘤细胞DNA含量

本文以吖啶橙为细胞DNA荧光探针,探讨了影响阿达玛变换显微图象分析仪定量分析细胞DNA时的细胞荧光强度以及影响人乳腺肿瘤细胞DNA定量分析结果准确性的几个因素,结果表明:(1)乙醇是理想的固定剂,醛类固定剂对细胞A()-DNA复合物的荧光有显著影响;(2)吖啶橙染色液中含Triton X-100时细胞荧光强度明显增大;(3)吖啶橙的最佳荧光染色浓度为50μg/mL;(4)在分析乳腺肿瘤细胞DNA含量(倍性)时,采用外标法(以人血涂片或淋巴结细胞涂上的淋巴细胞为标准二倍体细胞)或内标法(以乳腺肿瘤细胞涂片上的正常上皮细胞为标准二倍体细胞)均能得到较好结果,但后者更为可靠;(5)随机分析六十个以上肿瘤细胞,可得到较好分析结果.     

大肠杆菌O157:H7微滴数字PCR定量方法的建立

以大肠杆菌O157：H7(E. coli O157：H7)rfbE基因为靶基因,建立了可对其准确定量的微滴数字PCR( ddPCR)方法。对ddPCR反应中的探针浓度进行了优化,考察了方法的线性范围、精密度、定量限和检出限。最终确定ddPCR 反应中的最佳探针浓度为300 nmol/L。 E. coli O157：H7基因组 DNA 浓度范围为4~1.25×105拷贝/20μL ddPCR反应液时,ddPCR方法线性相关系数( R2)为0.999。当DNA浓度为760~88400拷贝/20μL 时,方法的精密度最好( RSD<5%)。本方法的定量限为4拷贝/20μL,检出限为3拷贝/20μL。特异性验证结果表明,建立的ddPCR方法特异性良好,对13份猪肉、牛肉和鸡肉样品的检测结果与定量PCR方法检出结果一致。     

小麦抗白粉病基因Pm12的RFLP标记

春小麦品系Line 31携带有一个来自斯卑尔脱山羊草的显性抗白粉病基因Pm 12(Miller等,1988)。16个RFLP(restriction fragment length polymorphism)探针用于鉴定Line 31及其亲本,结果表明Line 31是一个6B/6S易位系。用5个探针所进行的连锁分析进一步揭示Pm 12位于易位染色体的着丝点附近,与6S长臂上的α-淀粉酶位点(α-Amy-S1)紧密连锁,遗传距离仅为1.1 cM。本研究结果表明RFLP技术在鉴定小麦外源染色体及外源基因上具有广阔的应用前景。     

中国人苯丙氨酸羟化酶基因的限制酶位点多态性研究

本文应用人类苯丙氨酸羟化酶(PAH)cDNA作杂交探针,分析了80例中国正常人和28例苯丙酮尿症(PKU)患者PAH基因的八个限制性内切酶多态性位点:Bgl Ⅱ 3.6kb/1.7kb,EcoRI 17kb/11kb,EcoRV 30kb/25kb,Hind Ⅲ 4.2kb/4.0kb,Msp Ⅰa 23kb/19kb,Msp Ⅰb 4.0kb/2.2kb,Pvu Ⅱa 19kb/6.0kb和Pvu Ⅱb 11.5kb/9.1kb。测得中国人正常PAH基因的上述限制酶位点多态性(RFLP)的发生频率分別为0.13,0.83,0.77,0.81,0,12,0,04,0.70和0.10;而缺陷PAH基因的上述RFLP发生频率分别为0.12,0.93,0.89,0.81,0.04,0,0.69和0.04。这表明中国人的PAH基因限制酶位点多态性和白种人的有较大差异。可以通过PAH基因的RFLP检查进行中国人PKU的产前诊断。     

基于不同电化学探针检测乳腺癌基因片段电化学传感器的研究

构建了以3种不同电活性物质(铁氰化钾平衡电对、亚甲基蓝和六氨合钌)为电化学信号探针,检测乳腺癌基因片段(乳腺癌DNA)的电化学传感器。利用吸附作用将探针ss DNA固定于金纳米-多壁碳纳米管-Nafion复合纳米材料修饰金电极表面,制备了DNA电化学传感器。采用循环伏安法、电化学阻抗法和微分脉冲伏安法,对DNA电化学传感器进行表征和定量分析。实验结果表明,在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]-5mmol/L K4[Fe(CN)6]平衡电对电化学探针检测液中,乳腺癌DNA的线性范围为0.1~500.0 nmol/L,其检出限(S/N=3)为0.03 nmol/L。以20μmol/L亚甲基蓝为电化学探针检测液时,乳腺癌DNA的线性范围为1.0~500.0 nmol/L,检出限为0.3 nmol/L。利用50μmol/L六氨合钌电化学探针检测时,乳腺癌DNA的线性范围为1.0~500.0 nmol/L,检出限为0.3 nmol/L。3种电化学探针中,利用铁氰化钾平衡电对探针检测乳腺癌DNA的检出限最低,线性范围最宽。该传感器可用于其他DNA的检测分析。     

蚕豆16S rRNA基因前导顺序的一级结构分析

通过测定蚕豆16S rRNA基因前导顺序的一级结构并和其它物种相应顺序的比较发现:(1)在蚕豆16S rRNA基因上游不存在F1和X蛋白基因;(2)蚕豆的F3的保守区域更接近于保守顺序;(3)蚕豆的F3的—10区3’端后更富含A-T核苷酸对;(4)油菜、烟草、玉米和菠菜的16s rRNA基因5’端上游能形成一个稳定的基环结构,而蚕豆则不能。我们由此认为蚕豆的rDNA启动子比油菜的要强,增加转录是一个担负起两个rDNA拷贝功能的原因之一。     

家蚕核多角体病毒的多角体蛋白基因

本文用AcMNPV多角体蛋白质基因的克隆DNA作探针,从BmS NPV DNASal Ⅰ酶酶解片段基因库中筛选出一个有同源顺序的克隆pBN 61。该克隆含大小为1.65 kb插入DNA片段。本文报道了该片段的Hind Ⅲ,Hpa Ⅱ和Alu Ⅰ等限制性内切核酸酶酶切图谱分析和部分DNA顺序分析结果。测得的DNA顺序中有138个碱基与已报道的BmSNPV多角体蛋白质一级结构中的46个氨基酸顺序相比较,除一个氨基酸发生变化外,其余完全相一致。克隆pBN 61可能包含完整的Bm SNPV多角体蛋白质结构基因。     

野生大豆(Glycine soja SH1)球蛋白glycinin Gy4基因家族的两种表达拷贝

本文研究我国野生大豆(Glycine soja)种子贮藏蛋白基因的结构,并与栽培大豆进行比较,构建成野生大豆Glycine soja SH1和栽培大豆Glycine max子叶cDNA库。用已知含球蛋白glycinin Gy 4基因的克隆DNA λS 312为探针,从两个cDNA库中分离出6个克隆。其中两个克隆pWS 228与pWS 242含全长cDNA,克隆cDNA的限制酶图谱和cDNA与基因组DNA的Southern法杂交表明它们代表野生大豆球蛋白glycinin Gy 4基因家族的两种表达拷贝。pWS 228 cDNA的部分序列已测定并与栽培大豆相应顺序作比较。分子杂交还证明Ⅱ类glycinin基因家族的组编在野生大豆胚形成过程中的变动。     

蚕豆16Sr RNA基因的一级结构分析

蚕豆叶绿体DNA属无反向重复顺序类型,这种类型的16s rRNA基因的一级结构本文属首次报道。我们采用了洪国藩的非随机DNA顺序测定法,测出蚕豆叶绿体16s rRNA基因金长为1491bp。通过比较及遗传距离图的构建表明蚕豆16SrRNA基因的变化速率比具有反向重复顺序类型的烟草、油菜及玉米的要快,说明反向重复顺序具有降低反向重复顺序内的DNA变化速率的功能。同时我们的结果也支持了Kolodner等人关于反向重复顺序能重组交换进行异源修复的推测。     

超小荧光二硫化钨量子点的水热合成及细胞成像应用

以钨酸钠和半胱氨酸为原料, 采用水热法一步合成了具有超小粒径(约2 nm)的二硫化钨荧光量子点(WS₂ QDs). 利用透射电子显微镜(TEM)、 荧光光谱、 X射线光电子能谱(XPS)、 红外光谱(FTIR)和X射线衍射光谱(XRD)对其进行了表征, 并考察了其稳定性和细胞毒性. 结果表明, 制备的WS₂ QDs具有水溶性好、 稳定性高和细胞毒性低的优点. 将此WS₂ QDs用于人乳腺癌细胞(MCF-7)的成像, 并通过溶酶体荧光探针进行共定位, 发现此WS₂ QDs可能借助溶酶体进入细胞内.     

水稻腊质基因分子特性的研究

水稻腊质基因(Wx)负责胚乳与花粉粒中直链淀粉的合成。我们通过对限制图和DNA顺序有重叠的两个基因组克隆的分析,测定出了水稻Wx基因全长为5499bp的DNA顺序。比较水稻、玉米(Klsgen等)和大麦(Rohde等)中Wx基因的DNA顺序,弄清水稻Wx基因中存在13个内含子和14个外显子,通过微机对外显子顺序的翻译,得出了水稻Wx蛋白包括转运肽在内的609个氨基酸的排列顺序,并计算出它的分子量约为72kD。经比较,水稻Wx成熟蛋白的氨基酸顺序与玉米、大麦的没有明显地差异。但是,水稻Wx基因5′-上游区、3′-下游区和内含子区域的DNA顺序,以及Wx前体蛋白的转运肽区域的氨基酸顺序与玉米和大麦Wx基因的相应区域相比,它们之间的同源性却很低。     

基于电沉积导电聚合物薄膜的高灵敏DNA电化学传感器

利用电沉积导电聚合物薄膜,提出了一种对乳腺癌相关的BRCA-1基因的高灵敏检测方法．以Au电极表面自组装DNA捕获探针,利用电沉积在DNA修饰电极表面固定含Ss^2＋/3＋的导电高分子作为电子传递媒介体．通过夹心法杂交目标靶DNA及辣根过氧化物酶标记的信号DNA探针．靶DNA杂交的信号探针上的辣根过氧化物酶与检测溶液中的过氧化氢反应,采用时间．电流（T-I）法,可以灵敏检测BRCA-1基因,其检测限可以达到10fM．     

可用于活细胞线粒体随机光学重构超分辨成像的分子内可逆环化五甲川菁染料探针

基于单分子定位的随机光学重构超分辨成像作为一种先进的光学成像方法,可用于尺寸小于光学衍射极限的生物结构的超清晰成像,为在单分子层面研究疾病的发病机制及寻找精准的治疗策略提供有力研究工具,在生物医学领域有着广泛的应用前景.随机光学重构超分辨成像技术依赖于标记探针的光物理性质,探针需要在大量缓冲试剂及含巯基试剂存在下才能产生稳定光致闪烁进行超分辨成像,获得理想的超分辨成像结果,但是大量缓冲试剂与巯基试剂对活细胞伤害较大,使得其在活细胞的超分辨成像应用上存在困难,而限制了其在生物医学成像领域的进一步应用,因此,需要开发可用于活细胞的单分子定位超分辨成像的新型光学探针.本工作提出了一种新的可用于单分子定位超分辨成像的五甲川菁染料探针,不需要外加成像缓冲液及巯基试剂就可以产生光致闪烁变化.基于此,开发了一种分子内自发开、关环反应的新型五甲川菁染料探针,具有活细胞膜通透性.探针不需要使用缓冲液体系及对细胞有害的含巯基试剂,在低功率单束激光直接照射下产生光致闪烁,探针对活细胞没有产生明显毒性,适合活细胞的超分辨成像.进入活细胞后探针选择性定位于细胞线粒体上,在激光照射下产生光致闪烁,电子倍增电荷耦合器相机（EMCCD）在采样频率60 Hz下收集不同条件下的光致闪烁图像,设置不同参数进行结果分析,使用ImageJ进行图像预处理后再使用Falcon算法重构获得活细胞线粒体的超分辨成像图像,相比宽场成像,成像分辨率明显提高,为生物医学光学成像提供新的研究手段.     

具有特殊结构和电子性质的PdAu/Al2O3催化剂上蒽醌加氢反应性能

通过改变Pd和Au的负载顺序合成了一系列具有不同结构和电子性质的PdAu双金属催化剂, 并用于蒽醌加氢反应. 其中通过先负载Au后负载Pd的顺序制得的Pd/Au/Al₂O₃催化剂, 其加氢效率可高达14.27 g·L^-1.X射线衍射、透射电子显微镜、H₂程序升温还原和X射线光电子能谱等分析表征结果显示, Pd/Au/Al₂O₃催化剂中分散在Au颗粒表面的Pd纳米颗粒具有独特的爆米花结构, 其表面零价态的单质Pd含量最多, 而这种表面零价态的单质Pd是蒽醌加氢反应中的关键活性组分. 此外, Au的加入可有效抑制副反应的发生, 减少降解产物的生成, 从而大大提高了催化选择性.     

电化学石英晶体微天平实时表征和定量检测短序列DNA

利用电化学石英晶体微天平(EQCM)这一灵敏的质量和电化学传感器测定特定序列DNA。应用自组装膜技术在压电石英晶振表面自组装一带羧基的α－硫辛酸单层膜,通过盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)共价固化寡聚核苷酸为探针,用于测定与其碱基序列互补的DNA。实验中EQCM实时监测了α-硫辛酸的自组装过程、探针固化过程及其与cDNA杂交过程。定量得出了探针固化量及cDNA杂交量。在酸性、中性和碱性条件下,分别对固化和杂交过程进行表征,实验发现探针固化及DNA杂交都受pH影响,本文对此现象进行了解释。同时,利用染料Hoechst33258的电化学活性,使其与双链DNA嵌合,通过测量Hoechst33258的电化学信息进一步验证了DNA杂交关键步骤。     

人胃癌细胞株转化基因的克隆和核苷酸序列的分析

本文用人胃癌细胞株BGC-823总DNA对小鼠及大鼠成纤维细胞进行转染。用分子杂交方法证明大鼠第二轮恶性转化细胞基因组中合有来自人胃癌的转化基因,它与存在于正常细胞中的原癌基因c-Ha-ras同源。以λ噬菌体EMBL 3为载体,构建大鼠第二轮转化细胞基因组文库,以人Alu重复序列和c-Ha-ras为探针,将人胃癌细胞转化基因Ha-ras从文库中克隆分离出。用M13——双脱氧法测定转化基因第一、第二外显子核苷酸序列。结果表明转化基因除了第一外显子中有一个碱基发生变化外,核苷酸序列与原癌基因完全相同。