全内反射荧光显微术

全内反射荧光显微技术是当今世界上最具前途的新型生物光学显微技术之一，可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。它利用全内反射产生的隐失波照明样品，使照明区域限定在样品表面的一薄层范围内，因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比和对比度。近上来，已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。本文系统的介绍了全内反射荧光显微技术的原理。国内外的发展和现状及其在生物学上的应用，并对其未来做了展望。     

纳米光学和生物单分子探测

纳米光学技术展示了纳米级探测本领，同时生物单分子探测所需要分辨尺度也是纳米数量级的，因此在生物单分子探测过程中，纳米光学发挥了巨大的作用．文章介绍了与生物单分子探测技术相关的纳米光学技术，包括量子近场光学探针技术、近场光学成像技术(包括扫描近场光学显微术及全内反射荧光显微术)和激光光钳测控技术及它们在生物单分子探测上的进展，从而在染色、成像、测控三个方面展示了纳米光学技术在生物方面的应用，并对其未来的发展方向进行了展望．     

活细胞内的单分子荧光成像方法

文章介绍近年来新发展的几种重要的活细胞内单分子荧光成像方法,如转盘式共聚焦显微术、全内反射荧光显微术、荧光共振能量转移技术等。通过介绍它们的原理、特点和在活细胞内单分子行为研究中的应用实例,展示了这些新方法在生命科学领域广阔的应用前景。     

光学元件亚表面缺陷的全内反射显微检测

 光学元件亚表面缺陷的有效检测已成为高阈值抗激光损伤光学元件制造的迫切要求。基于全内反射照明原理开展了全内反射显微技术检测光学元件亚表面缺陷的实验研究。结果表明：全内反射显微技术可有效检测光学元件亚表面缺陷;入射光偏振态和入射角度会影响元件内界面下不同深度处驻波形式照明强度的分布,对于可见度发生明显改变的微小缺陷点能衡量出其一定的深度尺寸范围;利用显微镜精密调焦对界面下一定深度处缺陷成像,可知缺陷点的位置深度。     

全内反射荧光显微术应用于单分子荧光的纵向成像

利用这种显微术中激发场的纵向强度呈指数衰减的分布特性，测得的荧光强 度将强烈依赖渗透深度（强度衰减到1/e时的距离），从而快速直接的确定单分子荧光 团间的纵向间隔、每个荧光团的纵向绝对位置和荧光团的半径大小，即实现荧光分子三维分 布的重构.在整个重构的过程中，只需要改变一次入射角的大小，即只需探测两幅荧光分子 的全内反射成像. 关键词： 全内反射荧光显微术 纵向重构     

结合虚拟单像素成像解卷积的双边照明光片荧光显微技术

光片荧光显微术(light-sheet fluorescence microscopy, LSFM)采用薄片光束从侧面激发样品,在垂直于光片方向上进行成像,具有成像速度快、光学层析能力强以及光漂白和光毒性低等优点,适用于对较大活体生物样品进行高质量、长时间三维动态观测.然而,传统高斯光束LSFM存在分辨率低和成像视场小的问题.本文在双边照明LSFM的基础上,结合虚拟单像素成像解卷积技术,提出了一种大视场高分辨双边照明LSFM,实现了视场和分辨率的同时提升.设计和搭建了双边照明LSFM,开展了荧光珠和转基因斑马鱼样品的三维光切片显微成像实验,实验结果证明了系统的三维高分辨成像能力,对于大视场、高分辨LSFM的发展和应用具有重要意义.     

全内反射双通道观察双标记荧光染色的非洲绿猴肾细胞

在像增强型电荷耦合器件(ICCD)荧光显微成像装置上用双通道成像方法观察了非洲绿猴肾细胞(COS-7)中由EGFP转染的肌球蛋白Myosin 15a,以及Rhodamine标记的细胞微丝。为观察微丝尖端的肌球蛋白Myosin 15a,采用了高灵敏、低损伤的全内反射激发荧光显微成像技术,并在双通道中选用合适滤光片组合消除两种荧光染料间的光谱串扰。实验观测到非洲绿猴肾细胞内过表达的肌球蛋白Myosin 15a和伸长的微丝的分布情况,尤其是清晰观察到Myosin 15a在微丝上的分布。为全内反射双通道荧光成像技术在生命科学中的应用展示了广阔的前景。     

入射光的偏振特性对全内反射荧光显微术中荧光激发的影响

基于麦克斯韦的电磁场理论，研究了在全内反射荧光显微术中不同偏振态的入射光所产生的 不同偏振的隐失场以及对不同取向的荧光分子荧光发射的影响.理论分析结果表明，p偏振的 入射场将产生椭圆偏振的隐失场，s偏振的入射场将产生s偏振的隐失场.随着荧光分子三维 取向的不同，这两种隐失场的激发荧光效率也将不同，由此引起荧光发射强度的各向异性分 布.据此特性，可以实现对膜表面分子三维取向的成像. 关键词： 全内反射 荧光显微术 隐失波 偏振态     

超分辨率成像荧光探针材料应用进展

为了进一步认知复杂环境中的细胞生物学过程,研究人员发展了各种各样的生物成像技术。在这些技术中,生物荧光成像因简单的成像条件以及对生物样品的相容性而得到了广泛的发展。然而,传统的荧光成像技术受到了光学衍射极限的限制,无法分辨低于200 nm的空间结构,阻碍了对亚细胞结构的生物学过程研究。超分辨荧光显微镜技术突破了传统光学衍射对成像分辨率的限制,能够获取纳米尺度的细胞动态过程。除了对传统的宽场荧光显微镜框架的改进及升级改造之外,目前典型的超分辨成像显微镜技术通常依赖于荧光探针材料的光物理性质。常用的荧光探针材料包括荧光蛋白、有机荧光分子和纳米荧光材料等。本文介绍了几种主流的超分辨荧光显微成像技术并总结了已经成功应用到超分辨生物荧光成像中的荧光探针材料的应用进展。     

散斑照明宽场荧光层析显微成像技术研究

介绍了一种新的宽场荧光层析显微方法.在传统宽场显微镜中引入散斑图案照明样品,控制散斑图案的动态变化,利用CCD相机记录对应的一系列荧光图像.由于焦平面内强度变化远比焦平面外强度变化剧烈,通过合适的算法能够获得焦平面的层析分辨的荧光显微图像.标定了系统参数,并研究了不同的图像重建算法对系统性能的影响,获得了不同生物组织样品的层析图像.实验表明,该显微方法能用于组织光学切片成像,在临床医学中具有实际应用价值. 关键词： 荧光 散斑照明 荧光显微 层析     

拉直的单个DNA分子的全内反射荧光实时成像研究

全内反射荧光(TIRF)成像技术利用穿透深度仅200 nm左右的隐失波来激发诱导荧光,探测灵敏度和图像信噪比大大提高,成为单分子研究的有力工具。分子梳技术利用DNA末端与固体表面的结合力和周围流体流动产生的侧向力将DNA分子拉伸并平铺在表面上。结合这两种技术,对分子梳拉直的单个DNA分子进行了清晰的实时荧光成像,发现TIRF成像条件下DNA分子与荧光探针YOYO-1组成的复合体可自然避免发生光敏断裂现象;实时监测了单个DNA-YOYO-1复合体的光漂白过程,通过对激发光照射时间与探测器曝光时间进行同步控制,可大幅降低光漂白程度,为拉直的单个DNA分子的长时间实时观察和成像研究优化了实验条件,为实时、可视化地研究其与蛋白质相互作用的动力学过程奠定了基础。     

离焦系统下的单分子三维取向研究

提出了一种新思路来确定单分子的三维取向,在全内反射荧光显微成像的基础上,在显微镜的油镜上加一个水层,水和油的折射率不同造成光程差,产生离焦,利用全内反射产生隐失波激发了单分子的纵向分量,并在探测器前增加了一个分光镜,把光路分成偏振方向相互垂直的两束光,使得探测器上的光场分布包含单分子三维取向的信息。推导了隐失场激发的偶极矩光场在探测器上的光强分布表达式,通过分析偏振方向相互垂直的两束光在探测器上的不同的强度分布,来判断单分子偶极矩的三维取向。     

透射式扫描近场光学显微镜探针光场分布及其受激荧光分子光场分布研究

通过利用经Grober发展的Bethe模型,计算了透射式近场光学显微镜探针针尖附近及进入样 品后的光场分布,研究了它的横向分辨率、透射深度、透射系数等问题.模拟在光学近场激 发下生物荧光分子成像的过程,研究了荧光分子的极化方向和入射光偏振方向对信号收集的影响,发现荧光图像是偏振极性和荧光分子极性共同作用的结果. 关键词： 近场光学 光场分布 荧光分子成像     

光学分子成像技术观察纳流芯片对DNA分子的研究

λ-DNA与荧光染料YOYO-1结合，利用荧光显微技术对DNA分子在毛细现象作用下进入宽40 nm、深60 nm的纳米沟道内，并在其内部被拉伸以及沿沟道移动的情形进行了观察.讨论了DNA分子在沟道内的运动情况.结合光学分子成像技术与该尺寸范围的纳流芯片，将有助于研究生物分子的动力学和静力学性质.     

单个心肌细胞内钙波的微观动力学研究

利用基于近场光学原理构建的全内反射荧光显微镜研究了大鼠单个心肌细胞中的钙信号. 利用这种显微镜的快速成像和高信噪比的特点，观察到单个细胞中复杂的二维钙波斑图. 分析了单个钙信号释放事件在钙波形成、运动过程中的作用. 建立在fire-diffuse-fire模型基础上的模拟显示，由基本钙释放事件组成的钙波可以在心肌细胞中稳定存在. 此研究对进一步认识活体可激发系统的微观动力学行为有指导意义. 关键词： 近场光学 全内反射荧光显微镜 心肌细胞 钙波     

单分子定位超分辨显微成像技术研究进展及展望(特邀综述)

随着新型荧光探针、先进激光、高灵敏光电探测器等相关领域的不断发展,突破衍射极限的超分辨光学显微技术为现代生物医学研究提供了新的有力工具,其中的单分子定位技术利用荧光分子的光开关效应,实现了亚细胞结构的纳米精度超分辨成像.本文介绍了单分子定位超分辨显微技术的基本原理与实现,例举了其在细胞生物学、组织生物学以及神经科学等方面的应用,讨论了该技术目前的发展趋势及可能的改进方向,为相关领域科学研究提供参考.超分辨光学显微技术的不断创新将推动生命科学的新发展.     

中国科学院生物物理研究所生物成像中心简介

<正>中国科学院生物物理研究所的生物成像中心是中科院蛋白质科学研究平台二期建设当中的重点项目。该中心定位于生命科学研究前沿,致力于实现对生物学对象从纳观尺度到介观尺度的高分辨率三维成像技术,通过对生物超微高分辨率三维结构的研究来回答生命科学的关键问题。目前,该中心集成了超分辨率光学显微技术、低温电子显微技术、三维重构技术、低温扫描微加工技术、单分子荧光成像技术、光电关联显微成像技术以及一系列生物显微成像样品技术,并承担了北京及周边地区生物显微成像技术服务工作,极大促进了相关生命科学前沿研究的进展,成为我国生命科学基础研究的重要支撑平台。     

全内反射瞬逝场照明高精度磁镊及其在DNA解旋酶研究中的应用

传统磁镊的测量精度受限于磁球的布朗涨落, 当磁力小于约10 pN时, 磁球的布朗涨落明显增大, 对应磁镊的空间分辨率显著下降. 为了提高传统磁镊在小力条件下的测量精度, 本文将全内反射荧光技术引入到磁镊技术中, 并建立相适应的“磁球-手柄-荧光微球-待测生物分子”单分子连接系统, 在小力条件下(小于10 pN)获得纳米量级的测量精度. 应用改进的磁镊对DNA发卡的折叠-去折叠态的转变过程进行了研究, 依据DNA发卡的折叠-去折叠态转变的性质对全内反射场的穿透深度进行了校正, 并结合实验结果对改进后的磁镊的测量精度进行分析. 观察了Bloom解旋酶的解旋动力学过程, 获得初步实验结果, 证实了改进的磁镊在单分子研究中的实用性. 关键词： 磁镊 全内反射荧光 DNA发卡 解旋酶     

双色荧光辐射差分超分辨显微系统研究

为了拓展荧光辐射差分(Fluorescence Emission Difference,FED)显微术的应用,使得该方法可以同时对生物样品的不同组织结构进行超分辨成像,本文对双色FED显微系统展开了研究。FED的基本原理是将实心光斑扫描得到的共焦显微图像减去空心光斑扫描得到的负共焦图像,以此获得超分辨显微图像。在对单色FED显微系统进行研究后,本文提出了一种可行的双色FED显微成像系统方案。实验结果表明,在488 nm和640 nm激发光下,该系统在荧光颗粒上分别实现了135 nm和160 nm的空间分辨率,另外也能对生物样品的不同组织进行多色同时超分辨显微成像,满足了实际应用的要求。     

新型显微技术使生物成像深度和速度提高10倍

中科院西安光机所瞬态光学与光子技术国家重点实验室姚保利研究组,将基于数字微镜器件和LED照明的显微技术成功用于生物医学研究,从而为深层生物样品大面积快速三维成像提供了一种新的技术手段。相关成果日前发表在《自然》子刊《科学报告》杂志上。