利用分子梳方法研究单个DNA-YOYO-1复合体的光漂白性质

利用分子梳方法结合荧光显微术对单个DNA-YOYO-1复合体的光漂白过程进行了研究,发现单个DNA-YOYO-1复合体的光漂白是一个随光照时间指数衰减的过程,并给出了DNA拓扑结构以及光照强度对光漂白过程的影响.     

应用分子梳技术对DNA与组蛋白相互作用的研究

利用分子梳技术对λ DNA和组蛋白的相互作用进行了研究. 通过这种简单有效的方法，我们将λ DNA分子拉伸到26—28 μm，相当于其原长（约162 μm）的16—17倍. 当组蛋白与DNA结合后，DNA分子发生凝聚现象，复合体的拉伸长度明显变短，其峰值分布在10—14 μm之间. DNA 组蛋白复合体的拉伸长度与组蛋白的浓度、与碱基对和荧光染料的比例有显著的关系. 关键词： 分子梳 组蛋白 DNA 荧光显微     

光学分子成像技术观察纳流芯片对DNA分子的研究

λ-DNA与荧光染料YOYO-1结合，利用荧光显微技术对DNA分子在毛细现象作用下进入宽40 nm、深60 nm的纳米沟道内，并在其内部被拉伸以及沿沟道移动的情形进行了观察.讨论了DNA分子在沟道内的运动情况.结合光学分子成像技术与该尺寸范围的纳流芯片，将有助于研究生物分子的动力学和静力学性质.     

单分子尺度的光量子态调控与单分子电致发光研究

分子尺度上的光电相互作用研究可以为发展未来信息和能源技术提供科学基础.扫描隧道显微镜不仅可以用来观察和操纵纳米世界中的原子和分子,而且其高度局域化的隧穿电流还可以被用来激发隧道结中的分子,使之发光,以研究局域场下的分子光电特性.本文综述了中国科学技术大学单分子光电研究组近期在锌酞菁分子电致发光方面取得的科学进展,包括：1）利用有效的电子脱耦合与纳腔等离激元调控技术,实现了隧穿电子激发下的单个锌酞菁分子的电致荧光,并通过发展相关的光子发射统计测量方法,表征了单个分子在隧穿电子激发下的电致荧光具有单光子发射特性;2）发展了具有亚纳米空间分辨的荧光光谱成像技术,实现了对酞菁分子间相干偶极相互作用特征的实空间观察;3）对分子与纳腔等离激元之间的相干耦合作用进行了亚纳米精度的操控,在单分子水平上观察到了法诺共振和兰姆位移效应.这些研究结果不仅为研发基于有机分子的电泵纳米光源与单光子光源等分子光电器件提供了新的思路,而且为在单分子尺度上研究分子光电特性、分子间能量转移以及场与物质之间的相互作用规律等提供了新的表征方法.     

正交像散高密度三维单分子定位显微的数值模拟

单分子定位显微(single molecule localization microscopy, SMLM)成像技术利用荧光分子的稀疏发光、探测及定位,实现了纳米级空间分辨率的超分辨成像.为了提高其时间分辨率,需要提高同时发光的荧光分子密度.但随着分子密度的提高,不同分子的点扩散函数(point spread function, PSF)在探测器上将发生严重的重叠现象,导致空间分辨率降低,尤其是在进行三维SMLM成像时.为了解决这一问题,本文提出了一种基于正交像散的高密度三维单分子定位超分辨成像方法,并对该方法进行分析和数值模拟研究.该方法的核心是在单分子定位显微镜中将采集的荧光分成两束成像在同一个探测器的两个区域,并在两个通道中各引入一个光学参数相同但取向相互正交的柱透镜,实现对同一个荧光分子正负两个像散PSF图像的同时探测,然后建立该成像过程的线性投影模型,利用压缩感知算法求解出荧光分子的三维定位信息.结果表明,由于两个正交柱透镜产生的一组正交像散PSF对作为一个分子的系统响应时具有较低的相关性,该方法的高密度三维定位准确性可显著优于采用单个柱透镜的传统像散方法,且离焦程度越大两个...     

激光单分子探测技术的研究

文中介绍利用激光激发分子荧光的方法探测液体中单个染料分子的新技术，以及作者自行设计和研制的激光单分子探测谱仪。通过探测“光子爆发”，把单个染料分子的荧光同很强的背景杂散光区别开来。进一步用８２ＭＨｚ高重复频率的锁模激光器和时间门符合技术，成功地消除了Ｒａｍａｎ散射光。目前该谱仪达到的检测限为灵敏区内仅有～７个Ｒ６Ｇ分子。     

三氯六氨络合钴导致DNA凝聚的分子梳研究

利用分子梳技术和动态光散射研究了三氯六氨络合钴和DNA分子之间的相互作用. 从荧光显微镜中可直接观察到经YOYO-1染色后?-DNA分子的平均伸直长度比未染色的DNA分子增长约30%. 这是由于荧光染料YOYO-1分子插入双链DNA的碱基对中从而使DNA分子的长度增加. 另外研究了染色后的DNA-[Co(NH₃)₆]³⁺混合物的伸直长度随三氯六氨络合钴浓度的变化关系,实验结果表明当钴离子浓度从0增加到3 μmol/L,其混合物的伸直长度由原来的20.9 μm减小到5.9 μm. 利用动态光散射技术证实了这个结果,发现在相同的实验条件下加入钴离子前后DNA-Co(NH₃)₆]³⁺混合物的流体力学半径从203.8 nm减小到39.26 nm.     

DNA纳米传感器荧光成像技术

把基于量子点的DNA纳米传感器模型应用到ICCD荧光显微成像系统中,利用量子点的量子产率高、荧光寿命长、激发谱宽而发射谱窄、发射波长可由材料尺寸调谐等特性,以量子点为供体,Cy5(一种小分子荧光染料)为受体,结合ICCD系统的全内反射荧光成像功能、实时成像功能和双通道成像功能,证实了DNA纳米传感器可以在溶液中检测到含30个碱基的单链目标DNA片段。实时拍摄了溶液中链霉亲和素包被的量子点对两头分别连着Cy5和生物素的单链DNA片段(Cy5-ssDNA-Biotin)的捕获过程。并在活的中国仓鼠卵巢细胞样品中加入链霉亲和素包被的量子点和Cy5-ssDNA-Biotin进行实时荧光成像,拍摄到链霉亲和素包被的量子点和Cy5-ssDNA-Biotin进入细胞中并发生FRET的过程,初步表明了DNA纳米传感器在活细胞内进行DNA(或RNA)片段检测的可行性。     

荧光分子断层成像正向问题的并行计算

针对荧光分子断层成像中相应于激发光和发射光的两个正向方程必须串行求解的实际情况,提出了一种可同时对两个扩散方程进行求解的并行算法。其思想是通过引入乘子矩阵对耦合方程进行解耦来实现并行计算,并利用有限元方法进行了二维数值模拟,将算法求解所得结果与基于串行方法,以Ralf B．Schulz等提出的并行算法所得到的数值模拟结果进行了综合比较。实验表明,该算法一方面适合于任何大小的斯托克斯频移条件,具有更广泛的适应性;另一方面提高了荧光分子断层成像正向问题的求解速度和精度,从而有利于整个荧光分子断层成像的快速精确求解。     

全内反射荧光显微术

全内反射荧光显微技术是当今世界上最具前途的新型生物光学显微技术之一 ,可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。它利用全内反射产生的隐失波照明样品 ,使照明区域限定在样品表面的一薄层范围内 ,因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比和对比度。近年来 ,已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。本文系统的介绍了全内反射荧光显微技术的原理、国内外的发展和现状及其在生物学上的应用 ,并对其未来做了展望。     

Attoliter detection volumes by confocal total-internal-reflection fluorescence microscopy

We report a confocal total-internal-reflection fluorescence (TIRF) microscope that generates a detection volume for analyte molecules of less than 5 al (5 x 10(-18) l) at a water-glass interface. Compared with conventional confocal microscopy, this represents a reduction of almost 2 orders of magnitude, which is important in isolating individual molecules at high analyte concentrations, where many biologically relevant processes occur. Diffraction-limited supercritical focusing and fluorescence collection is accomplished by a parabolic mirror objective. The system delivers TIRF images with excellent spatial resolution and detects single molecules with a high signal-to-background ratio.     

Direct observation of λ-DNA molecule reversal movement within microfluidic channels under electric field with single molecule imaging technique

The electrodynamic characteristics of single DNA molecules moving within micro-/nano-fluidic channels are important in the design of biomedical chips and bimolecular sensors. In this study, the dynamic properties of λ-DNA molecules transferring along the microchannels driven by the external electrickinetic force were systemically investigated with the single molecule fluorescence imaging technique. The experimental results indicated that the velocity of DNA molecules was strictly dependent on the value of the applied electric field and the diameter of the channel. The larger the external electric field, the larger the velocity, and the more significant deformation of DNA molecules. More meaningfully, it was found that the moving directions of DNA molecules had two completely different directions:(i) along the direction of the external electric field, when the electric field intensity was smaller than a certain threshold value;(ii) opposite to the direction of the external electric field, when the electric field intensity was greater than the threshold electric field intensity.The reversal movement of DNA molecules was mainly determined by the competition between the electrophoresis force and the influence of electro-osmosis flow. These new findings will theoretically guide the practical application of fluidic channel sensors and lab-on-chips for precisely manipulating single DNA molecules.     

Quantification of Low Concentrations of DNA Using Single Molecule Detection and Velocity Measurement in a Microchannel

We present a novel method for quantifying low concentrations of DNA based on single molecule detection (SMD) for molecular counting and flow measurements inside a microchannel. A custom confocal fluorescence spectroscopic system is implemented to detect fluorescent bursts emitted from stained DNA molecules. Measurements are made one molecule at a time as they flow through a femtoliter-sized laser focal probe. Durations of single molecule fluorescent bursts, which are found to be strongly related to the molecular transit times through the detection region, are statistically analyzed to determine the in situ flow speed and subsequently the sample volume flowing through the focal probe. Therefore, the absolute concentration of a DNA sample can be quantified based on the single molecule fluorescent counts from the DNA molecules and the associated probe volume for a measured time course. To validate this method for quantifying low concentrations of biomolecules, we tested samples of pBR322 DNA ranging from 1 pM to 10 fM (∼3 ng/ml to 30 pg/ml). Besides molecular quantification, we also demonstrate this method to be a precise and non-invasive way for flow profiling within a microchannel.     

25 nm resolution single molecular fluorescence imaging by scanning near-field optical/atomic force microscopy

High-resolution single molecular near-field fluorescence images were observed by scanning near-field optical/atomic force microscopy (SNOM/AFM). We modified the SNOM/AFM for both high-resolution fluorescence imaging and high-resolution topographic imaging. The imaged fluorophore, Alexa 532, is prepared with a poly-methyl-methacrylate (PMMA) film coating. A fluorescence resolution of 25 nm was obtained with a simultaneous topographic image of a flat surface. A sample prepared with a lower PMMA concentration exhibited a rough surface in the micro area. The results for the flat surface indicated that the fluorescence resolution is worst in the rough surface sample, that the maximum fluorescence intensities for the individual fluorophore are similar, and that the decay rate is faster. Thus, we concluded that the morphological effect is an important factor in fluorescence image resolution and the apparent lifetimes of the fluorescence molecules.     

Total-internal-reflection fluorescence microscopy with W-shaped axicon mirrors

A scheme based on a W-shaped axicon mirror device for total-internal-reflection fluorescence microscopy (TIRFM) is presented. This approach combines the advantages of higher efficiency compared with traditional TIRFM, adjustable illumination area, and simple switching between wide-field and TIRF imaging modes. TIRF images obtained with this approach are free of shadow artifacts and of interference fringes. Example micrographs of fluorescently labeled polystyrene beads, of Convallaria majalis tissue, and of Propidium-iodide-labeled Chinese hamster ovary cells are shown, and the capabilities of the scheme are discussed.     

一种改进型单分子操纵装置及其应用

改进了单分子横向磁镊装置,可以直接用于观察单个DNA分子的伸长和扭转并随时更换样品池内的溶液,还可以同时操纵多个DNA分子,大大提高实验效率.此方法可以提供01到40pN范围的拉力,足以满足大部分单分子DNA实验的要求.用该装置实时观测到了DNA分子在拉力作用下的伸长以及在旋转磁场作用下的扭转,并成功地观察到了分子马达拉动DNA的动力学过程,从而验证了该装置的实用性. 关键词： 横向磁镊 单分子操纵 DNA拉伸 DNA扭转     

用全内反射瞬逝场照明磁镊研究Bloom解旋G-四联体

G-四联体(G-quadruplex,G4)是广泛存在于细胞基因组中的一种DNA结构,在DNA的代谢如复制、转录、同源重组等过程中起重要作用.G4解旋酶近年来受到广泛研究,其中Bloom(BLM)解旋酶的研究已经相当丰富,但仍有一些基本问题不清楚.我们应用全内反射瞬逝场照明磁镊对BLM解旋G4的动力学过程进行了深入研究,观察到了BLM解旋G4的分步过程.相对于单分子荧光共振能量转移技术而言,借助磁镊的长时间观测性能,我们在近饱和三磷酸腺苷(ATP)浓度的实验体系中观察到BLM长时间反复解开G4或者长时间维持G4于打开状态的两种作用方式.最后,使用相同的实验条件做了单分子荧光共振能量转移实验,确定了加载2-3 pN的外力对BLM解旋G4没有显著影响.     

一种共轭聚合物单分子发色团吸收和发射特性动态演变过程的实时测量

利用频域信息重构的散焦宽场成像测量了Poly[2,7-(9,9-dioctylfluorene)-alt-4,7-bis(thiophen-2-yl)benzo-2,1,3-thiadiazole](PFO-DBT)共轭聚合物单分子发色团的吸收与发射特性及其动态演变过程.通过调制用于激发共轭聚合物单分子的超短脉冲对的相对相位,对单分子荧光进行傅里叶变换的频域测量,跟踪发色团吸收偶极取向变化;通过测量散焦荧光成像光斑探测发色团发射偶极取向变化.研究发现, PFO-DBT共轭聚合物单分子发色团存在吸收和发射偶极取向均保持不变、其中之一变化以及两者同时变化三种情况.这种对共轭聚合物单分子发色团吸收和发射偶极取向演化过程的实时测量可用于分析共轭聚合物构象变化及其对能量转移过程的影响.