HeLa细胞突起中微丝束的纳米分辨荧光成像

在Matlab编程环境下模拟了单分子定位显微的纳米分辨成像,在传统实验参数条件下,对不同间隔分子带模型进行了模拟成像.模拟结果表明,单分子定位显微方法可以区分中心相隔20 nm的两个分子带.同时,也分析了不同像元大小对单分子定位精度的影响.此外,通过单分子定位显微方法在IX71倒置荧光显微镜上实现了纳米分辨,系统极限分辨率,即半高全宽为48 nm.在该系统上,获得了HeLa细胞突起中微丝束结构的纳米分辨图像.从重构获得的图像中可以看到微丝束的直径为75—200 nm.     

荧光单分子的频率域纳米级快速定位算法及其在超分辨荧光成像中的应用

为了解决现有单分子定位算法中定位速度慢和对噪声有评估依赖性的问题,基于补零快速傅里叶变换和相位梯度算子提出一种新型的噪声自由的频率域非迭代荧光单分子定位算法。计算机模拟结果表明该算法定位精度可达纳米量级,而定位速度与解线性方程组法在同一个数量级。进而在传统实验参数条件下,对不同间隔分子带模型进行了模拟超分辨成像。模拟结果表明,可以区分中心相隔30nm的两个分子带。此外,将该算法用于HeLa细胞突起中微丝束结构的荧光超分辨成像,从重构获得的图像中可以看到微丝束的直径为75～200nm,验证了该算法的实用性。     

单分子定位超分辨显微成像技术研究进展及展望(特邀综述)

随着新型荧光探针、先进激光、高灵敏光电探测器等相关领域的不断发展,突破衍射极限的超分辨光学显微技术为现代生物医学研究提供了新的有力工具,其中的单分子定位技术利用荧光分子的光开关效应,实现了亚细胞结构的纳米精度超分辨成像.本文介绍了单分子定位超分辨显微技术的基本原理与实现,例举了其在细胞生物学、组织生物学以及神经科学等方面的应用,讨论了该技术目前的发展趋势及可能的改进方向,为相关领域科学研究提供参考.超分辨光学显微技术的不断创新将推动生命科学的新发展.     

3D-STORM超分辨成像中单分子轴向定位精度优化研究

为定量描述柱透镜参数对三维成像过程中荧光分子轴向定位精度的影响,本文研究了柱透镜参数与点扩散函数椭圆率的相互关系.基于Olympus IX-83倒置荧光显微镜搭建成像系统,利用3个不同焦距柱透镜进行实验,通过柱透镜标定曲线的线性变化范围及该范围内曲线的斜率分析柱透镜参数选择上的优劣,优化并提高轴向定位的精度和深度.选择合适的柱透镜参数可实现标定曲线在焦平面上下1μm范围线性变化,轴向定位精度为16nm,并采用优化的标定曲线对肌动蛋白微丝进行三维超分辨成像.     

用于大景深单分子定位显微的多功能全息相位片的设计及数值模拟

发展具有大轴向定位范围的单分子定位技术对于实现厚样品的超分辨成像具有重要的价值.基于波前编码技术,将变形多值纯相位光栅与双螺旋点扩散函数相位片相结合,提出一种可以通过空间光调制器实现的具有高衍射效率的新型全息相位片的设计方法.这种全息相位片可以将样品内多个层面的分子信息以双螺旋的形式成像在同一个探测面的不同位置,在无需扫描的情况下提高双螺旋点扩散函数工程的轴向定位范围和分辨率,解决活细胞内单分子定位和示踪技术中的大景深探测难题.数值模拟表明,设计的5×5全息相位片可以将样品内25个层面上的分子信息以双螺旋的形式成像在同一探测面上的不同位置,相邻两个层面的间隔为0.5μm,实现了轴向12μm的探测范围,证明了设计的可行性.     

基于菲涅耳透镜色散的双波长荧光显微深度成像

提出一种非轴向扫描的细胞显微深度成像技术,在显微系统中加入菲涅耳透镜,利用菲涅耳透镜的色散将不同激发光波长聚焦到不同的轴向位置,以实现对两个或多个焦平面同时成像.基于405nm和532nm两种激发光波长,在传统的荧光显微镜的激发路径中加入对应的两个成像探测器来探测两个不同焦平面所对应像面的成像信息,搭建得到一个能够实现探测深度约为12μm的基于菲涅耳透镜的荧光显微深度成像系统,并与基于显微物镜色差无菲涅耳透镜的荧光显微深度成像系统的成像深度和轴向分辨率进行实验对比.实验结果表明:加入菲涅耳透镜能够实现系统对不同焦面的同时成像;对于同一荧光波段,保证系统横向分辨率的同时,扩大了成像景深.该系统可以实现荧光生物细胞内部不同深度处的多波段同时探测.     

离焦系统下的单分子三维取向研究

提出了一种新思路来确定单分子的三维取向,在全内反射荧光显微成像的基础上,在显微镜的油镜上加一个水层,水和油的折射率不同造成光程差,产生离焦,利用全内反射产生隐失波激发了单分子的纵向分量,并在探测器前增加了一个分光镜,把光路分成偏振方向相互垂直的两束光,使得探测器上的光场分布包含单分子三维取向的信息。推导了隐失场激发的偶极矩光场在探测器上的光强分布表达式,通过分析偏振方向相互垂直的两束光在探测器上的不同的强度分布,来判断单分子偶极矩的三维取向。     

基于人眼视觉的集成成像三维显示分辨率的比较

为了对不同集成成像系统三维显示应用中的视觉分辨效果进行表征, 提出了一种基于人眼视觉的集成成像三维显示分辨率的分析比较方法. 通过分析集成成像三维显示系统的分辨率与人眼在最佳显示观看距离下分辨本领的关系, 定义了相对分辨率参数, 分析了其与集成成像三维显示实际观看时视觉分辨效果的关系. 研究结果表明, 透镜阵列的大小对集成成像三维显示的视觉分辨效果有重要的影响. 针对两个系统实例的理论计算结果表明, 系统间的相对分辨率参数差异是传统分辨率差异的1.75倍, 实验结果与理论分析一致. 该研究方法对三维显示分辨率的评价有一定的指导意义.     

纳米光学和生物单分子探测

纳米光学技术展示了纳米级探测本领，同时生物单分子探测所需要分辨尺度也是纳米数量级的，因此在生物单分子探测过程中，纳米光学发挥了巨大的作用．文章介绍了与生物单分子探测技术相关的纳米光学技术，包括量子近场光学探针技术、近场光学成像技术(包括扫描近场光学显微术及全内反射荧光显微术)和激光光钳测控技术及它们在生物单分子探测上的进展，从而在染色、成像、测控三个方面展示了纳米光学技术在生物方面的应用，并对其未来的发展方向进行了展望．     

高效双螺旋点扩展函数相位片的设计与实验研究

双螺旋点扩展函数具有随离焦连续旋转变化的特性, 结合单分子定位方法可用于厚样品三维超分辨成像及分子定位追踪研究. 但双螺旋点扩展函数不足之处是光能利用率低, 对于光子数受限的荧光显微成像而言其应用受限. 本文通过对双螺旋点扩展函数在空域、频域和拉盖尔-高斯模式面等三个不同域中进行约束优化. 模拟结果表明, 优化后的双螺旋点扩展函数的光能效率提高了30多倍. 同时, 基于最优设计方案制备了相位片, 并实验验证了该设计的正确性. 与文献报道相比较, 本文结果在成像深度和光能利用率方面都有所改善. 关键词： 双螺旋点扩展函数 超分辨成像 轴向定位 优化算法     

远场超分辨随机光重建显微镜(STORM)研究进展

了解细胞内分子尺度的动态和结构的特征是生命科学迫切需要解决的问题,要求远场光学成像要求纳米或亚纳米量级的空间分辨率.介绍了一种实现打破衍射极限的远场荧光显微成像技术--随机光重建显微术(STORM),其分辨率可以达到横向分辨率20 nm,轴向分辨率50 nm,理论上这种方法的空间分辨率可以达到单分子定位的精度.具体介绍...     

基于渥拉斯顿棱镜的单路实时偏振成像系统设计

针对非实时成像中动态场景偏振探测产生的虚假偏振信息问题,充分利用渥拉斯顿棱镜的分光特性,设计了一种新型实时偏振成像系统.采用像方远心望远透镜系统、准直透镜系统并设计匹配的成像镜系统,在单探测器阵列上同时获取偏振态相互垂直的两幅偏振图像.通过全系统联动设计与优化,系统的调制传递函数在截止频率处不小于0.55,全系统弥散斑均方根半径小于5.3μm,即小于探测器像元尺寸,满足成像设计要求.仿真结果证明该成像系统可有效解决传统分振幅偏振成像系统的实时性差的不足,分孔径偏振成像系统的能量利用率和分辨率低的问题以及偏振焦平面方法中光路串扰的缺陷,应用前景广阔.     

拉直的单个DNA分子的全内反射荧光实时成像研究

全内反射荧光(TIRF)成像技术利用穿透深度仅200 nm左右的隐失波来激发诱导荧光,探测灵敏度和图像信噪比大大提高,成为单分子研究的有力工具。分子梳技术利用DNA末端与固体表面的结合力和周围流体流动产生的侧向力将DNA分子拉伸并平铺在表面上。结合这两种技术,对分子梳拉直的单个DNA分子进行了清晰的实时荧光成像,发现TIRF成像条件下DNA分子与荧光探针YOYO-1组成的复合体可自然避免发生光敏断裂现象;实时监测了单个DNA-YOYO-1复合体的光漂白过程,通过对激发光照射时间与探测器曝光时间进行同步控制,可大幅降低光漂白程度,为拉直的单个DNA分子的长时间实时观察和成像研究优化了实验条件,为实时、可视化地研究其与蛋白质相互作用的动力学过程奠定了基础。     

微球透镜超分辨显微成像与检测技术综述

受衍射极限的影响,传统光学显微镜的分辨率最高约为波长的一半,突破衍射极限,获得更高的成像分辨率是近年来显微成像领域的研究热点。相比于其他超分辨显微成像方式,基于微球透镜的超分辨显微成像方式具有简单直接、免标记等优点。主要介绍国内外研究团队将微球与传统的光学显微镜结合实现超分辨显微成像的研究进展,从微球透镜参数选择、成像方案、成像分辨率、成像视场及成像机理等多角度进行总结与比对;并结合课题组工作,介绍了将微球透镜与干涉显微技术相结合的三维超分辨检测技术,阐述了Linnik型与Mirau型两种检测光路原理,分析了三维超分辨检测的效果;展望了微球透镜超分辨显微技术在显微成像与显微干涉检测两个方面待解决的问题与发展方向。     

基于压缩感知的三维单分子定位显微成像方法研究

本文建立了一种三维压缩感知模型以实现对高密度荧光分子图像的快速三维定位。首先,根据荧光显微的三维点扩展函数成像理论,设计测量矩阵,并建立压缩感知模型。接着,对荧光显微成像过程进行了模拟,并采用凸优化方法(CVX)、正交匹配追踪(Orthogonal Matching Pursuit,OMP)算法和同伦算法对建立的压缩感知模型中模拟生成的图像进行了定位分析,分别从恢复率、定位精度、重构时间几方面进行了对比。最后,采用同伦算法对模拟的生物样品和实验室采集的细胞进行了三维定位,并获得了三维超分辨图像。对比结果表明:在重构密度和定位精度接近的情况下,同伦算法比CVX方法的重构速度快2个数量级。同伦算法较OMP算法的定位精度要高一倍。采用同伦算法来实现三维的超分辨荧光显微成像在节约计算时间、实现实时成像方面具有一定的意义。     

荧光显微镜自组实验设计

利用光学支架、透镜、滤光片、平移台等在光学面包板上组装了荧光显微镜,组装仪器是集白光照明成像、激光激发荧光成像、荧光光谱探测等功能于一体的开放式系统.利用光学分辨率板白光照明条件下测量了荧光显微镜的空间分辨能力,采集了荧光样品CdTe/CdS量子点的荧光光谱和荧光图像.     

多色单分子定位超分辨显微成像术

多色成像作为超分辨成像技术的重要延伸,极大地增强了人们研究亚细胞结构定位与交互关系的能力,从而有助于研究者深入理解细胞内复杂的生命现象与过程。基于单分子定位超分辨显微成像术(SMLM)工作原理的特殊性,已实现了激发依赖、激活依赖、分光依赖等数种有特点的多色成像方法。介绍6种主要的多色单分子定位超分辨显微成像技术,从分色能力、光谱窜扰、数据采集效率等角度分析了各方法的优缺点,并讨论了与多色成像相关的细胞固定方法,帮助研究人员根据自身实验需求选择合适可靠的多色成像手段研究相应的科学问题。     

转换屏发光光谱对闪光照相成像质量影响研究

转换屏的X射线激发发光光谱与透镜系统的匹配偏差会对闪光照相光电接收系统的成像质量造成影响.提出了一种一维线阵全分辨的模拟计算方法,对在理想光源照射下系统成像视觉全分辨能力进行了模拟计算.用白光光源加滤波片照明分辨率板的实验方法,对不同光源照射下系统的成像质量进行了评估.分析表明,转换屏发光宽光谱及其中心波长与透镜系统不匹配均对成像分辨率造成一定影响,而对图像对比度造成较大影响.只有在透镜系统针对的消像差波段540～550 nm附近窄带发光的转换屏,其成像质量才能基本不受匹配影响,近似于模拟计算的结果.     

基于点扫描的超分辨显微成像进展

光学显微镜一直推动着现代科学技术的发展.随着科学的进步,对显微成像分辨率的要求在生物、材料等领域日渐凸显,而常规宽场显微成像一直面临着成像分辨率衍射受限的问题.1968年出现的共聚焦显微镜作为点扫描显微镜的开端第一次实现了远场下成像分辨率的突破,它具有层切性好、信噪比高等优点.在1994年出现的受激辐射荧光损耗显微镜将显微成像能力突破到2.8 nm左右,并成为目前效果最佳、应用较广泛的超分辨显微技术.荧光差分显微和饱和荧光吸收竞争等点扫描技术具有无荧光染剂限制、饱和光强低、光路简单等优势,并且能取得1/6波长的分辨能力,进而在超分辨显微领域仍有着发挥空间.Airyscan技术作为以上方法的补充可以弥补点扫描系统中由于探测小孔半径减小而带来的信号丢失,从而提高成像信噪比和分辨率,但阵列探测器成本较高.上述点扫描显微镜通过改变照明或者探测的方式实现了分辨率突破.本文详细讨论了点扫描超分辨方法的原理、成像效果及面临的瓶颈,并分析了点扫描超分辨显微镜在应用和技术上的趋势.     

基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微

在传统共聚焦显微技术的基础上,图像扫描显微技术使用面阵探测器来代替单点探测器,结合虚拟数字针孔并利用像素重定位和解卷积图像重构算法将传统宽场显微镜的分辨率提高一倍,实现了高信噪比的超分辨共焦成像.但是,由于采用逐点扫描的方式,三维成像速度相对较慢,限制了其在活体样品成像中的应用.为了进一步提高图像扫描显微术的成像速度,本文提出了一种基于双螺旋点扩散函数工程的多焦点图像扫描显微成像方法和系统.在照明光路中,利用高速数字微镜器件产生周期分布的聚焦点阵对样品进行并行激发和快速二维扫描;在探测光路中,利用双螺旋相位片将激发点荧光信号的强度分布转换为双螺旋的形式;最终,利用后期数字重聚焦处理,从单次样品扫描数据中重构出多个样品层的超分辨宽场图像.在此基础上,利用搭建的系统分别对纤维状肌动蛋白和海拉细胞线粒体进行成像实验,证明了该方法的超分辨能力和快速三维成像能力.