单分子磁镊测量高亲和反应系数

介绍了一种基于单分子磁镊测量反应系数的分析方法,并以单链结合蛋白与单链DNA的结合过程为例,通过测量和计算,得出了相应的反应系数,并获得了反应的详细信息.     

用单分子技术研究Sso7d与DNA的相互作用

为了维持基因的稳定性,每种生物体都含有一套独特的染色质蛋白来保护脱氧核糖核酸(DNA)的结构,观察染色质蛋白对DNA结构的作用过程和结果,可以帮助人们了解这些蛋白的具体功能和作用机理.硫化叶菌是一种能在高温下存活的古细菌,Sso7d是硫化叶菌的一种染色质蛋白.深入地了解Sso7d和DNA链的相互作用,有助于解释硫化叶菌的DNA为何能在高温环境下保持活性,本文通过原子力显微镜(AFM)和磁镊两种单分子操作手段,研究了Sso7d与DNA的相互作用.AFM的实验结果给出了Sso7d与DNA的作用过程:结合Sso7d后,DNA首先发生弯折,然后出现loop结构,最终DNA会团聚为致密的核结构.利用磁镊装置测量了Sso7d的结合对打开DNA双链的影响,实验结果表明Sso7d的结合导致打开DNA双链的力的增大,经过数据分析,计算出Sso7d与DNA结合的结合能?G=3.1k_BT,平均每5.5个碱基对(bp)结合一个Sso7d,较高的结合密度和较大的结合能,两方面的作用结果,解释了Sso7d能够稳定DNA结构的原因.     

基于片层光照明的新型单分子横向磁镊

磁镊是一种高精度的单分子技术,它用磁场对连有生物大分子的超顺磁球产生磁力,通过追踪磁球的位置来测量生物大分子的长度信息.磁镊包括横向磁镊和纵向磁镊.纵向磁镊空间精度高,但昂贵;横向磁镊简单便宜,但由于受其成像原理的限制,一般情况下只能连接较长的DNA等生物大分子,且其空间精度较差,进而限制了其应用范围.为了解决这个问题,本文改进了横向磁镊,用片层光照明的方法使光线主要被磁球散射,从而能够直接观察到吸附在样品槽侧壁上的磁球,这使得测量短连接的底物成为可能.对于实际应用的检测,首先测试了包含270 bp发卡结构的0.5μm双链DNA,用其中发卡结构的"折叠-去折叠"跳变过程证明了改进后的横向磁镊的确可以追踪短DNA等生物大分子.然后,进一步用16μm的λ-DNA检验了实验系统.最后,将新型横向磁镊与普通横向磁镊及纵向磁镊在小力和大力条件下拉伸不同长度DNA的噪声进行了比较,发现改进后的横向磁镊在空间精度上明显优于普通横向磁镊,与纵向磁镊相比也无明显差异.以上结果证明了改进后的横向磁镊的精度优势,并扩展了横向磁镊的应用范围.     

Bloom's syndrome protein unfolding G-quadruplexes in two pathways

The Bloom helicase(BLM) gene product encodes a DNA helicase that functions in homologous recombination repair to prevent genomic instability. BLM is highly active in binding and unfolding G-quadruplexes(G4), which are noncanonical DNA structures formed by Hoogsteen base-pairing in guanine-rich sequences. Here we use single-molecule fluorescence resonance energy transfer(smFRET) to study the molecular mechanism of BLM-catalysed G4 unfolding and show that BLM unfolds G4 in two pathways. Our data enable us to propose a model in which the HRDC domain functions as a regulator of BLM, depending on the position of the HRDC domain of BLM in action: when HRDC binds to the G4 sequence, BLM may hold G4 in the unfolded state; otherwise, it may remain on the unfolded G4 transiently so that G4 can refold immediately.     

用全内反射瞬逝场照明磁镊研究Bloom解旋G-四联体

G-四联体(G-quadruplex,G4)是广泛存在于细胞基因组中的一种DNA结构,在DNA的代谢如复制、转录、同源重组等过程中起重要作用.G4解旋酶近年来受到广泛研究,其中Bloom(BLM)解旋酶的研究已经相当丰富,但仍有一些基本问题不清楚.我们应用全内反射瞬逝场照明磁镊对BLM解旋G4的动力学过程进行了深入研究,观察到了BLM解旋G4的分步过程.相对于单分子荧光共振能量转移技术而言,借助磁镊的长时间观测性能,我们在近饱和三磷酸腺苷(ATP)浓度的实验体系中观察到BLM长时间反复解开G4或者长时间维持G4于打开状态的两种作用方式.最后,使用相同的实验条件做了单分子荧光共振能量转移实验,确定了加载2-3 pN的外力对BLM解旋G4没有显著影响.     

单分子动力学研究大肠杆菌单链结合蛋白与单链DNA的结合过程

大肠杆菌单链结合蛋白(E.coli SSB)具有与单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)结合的性质,起着保护ssDNA及引导相关蛋白质反应的重要作用,然而,它与ssDNA的结合过程及其细节尚未得到确定的研究结果.本文采用单分子磁镊对E.coli SSB/ssDNA复合体进行拉力测试,并采用单分子化学反应动力学方法对测试结果进行分析.研究发现:E.coli SSB在ssDNA上的结合过程分为两个不同的阶段,一个是在临界力下快速的结合缠绕阶段,一个是随着力的进一步减小逐步缠绕的阶段.从中得到了E.coli SSB与ssDNA的化学反应系数,并得到了相应的自由能参数.采用自由能校准的方法,得到了SSB与ssDNA结合的完整自由能曲线,从而揭示了E.coli SSB与ssDNA的结合特征.本文的分析方法也可以应用于相似的化学反应的研究中.     

单分子技术研究T7解旋酶的解旋与换链

单分子荧光共振能量转移(smFRET)和磁镊(MT)技术目前广泛应用于研究分子马达.相较于常规技术,其具有高精度及动态观测的优点.本文研究对象为T7解旋酶,是六聚体解旋酶的典型代表.研究表明,这种解旋酶主要消耗脱氧胸苷三磷酸(dTTP)提供能量,且仅能沿着5′-3′单向进行行走和解旋工作.目前对于六聚体解旋酶的解旋和换链机制的认知仍然存在着诸多问题,因此本文主要以此作为切入点开展研究.首先通过运用smFRET技术研究T7解旋酶在不同DNA底物上的解旋现象,发现其需要3′-尾链参与到解旋工作中,但其为单链或双链结构并无明显区别;通过改变脱氧核糖核酸(DNA)序列中的GC含量,发现T7解旋酶随着序列中GC含量的升高会更容易在解旋过程中发生回退现象,导致解旋长度明显缩短;通过进一步分析发生回退先的实验数据,发现T7解旋酶除了可以瞬时回退到叉形DNA岔口或脱落外,还可以缓慢回退到叉形DNA岔口;运用MT技术研究该解旋酶,同样发现这种缓慢回退现象的存在.根据T7解旋酶解旋DNA遵循的单向性和极性,其只能沿着5′到3′方向进行行走和解旋.因此,本文推测这种缓慢回退的现象可能是解旋酶从5′-链转移至3′-链上,即发生换链过程;最后,本文提出了T7解旋酶在解旋过程中进行换链的模型,将有助于进一步理解环状六聚体解旋酶行使其功能的分子机制.     

New insight into the mechanism of DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET studies of Klenow fragment

We use single-molecule FRET and newly-developed D-loop techniques to investigate strand displacement activity of Klenow fragment (exo-) of DNA polymerase I in DNA sequences rich in guanine and cytosine (GC) bases. We find that there exist in the FRET traces numerous ascending jumps, which are induced by the backsliding of Klenow fragment on DNA chains. Our measurements show that the probability of backsliding is closely related to the GC-richness and dNTP concentration: increasing the GC-richness leads to an increase in the backsliding probability, and increasing the dNTP concentration however leads to a decrease in the backsliding probability. These results provide a new insight into the mechanism of DNA polymerase I.     

脂质体包裹荧光受体方法研究a-突触核蛋白在磷脂膜上的结构和动态特征

α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)在帕金森病的发病机理中起着关键的作用,因而近年来受到了越来越广泛的关注.α-syn在膜上的动力学过程对理解其功能至关重要.本文使用基于脂质体的单分子荧光衰减方法——LipoFRET,首次对较高浓度下α-syn与磷脂膜的相互作用的动态过程进行了单分子层面上的研究.研究发现,在溶液中α-syn浓度升高时,其中央NAC区域可离开磷脂膜表面进入水相中;而N端部分位于膜表面内的位置变浅,并有更高的概率脱离膜表面进入溶液中.利用单分子荧光成像对α-syn解离的观察则发现,随着溶液中的α-syn浓度升高,脂质体上的α-syn解离速率加快.因此高浓度下,α-syn在膜上各区域垂直位置变化促进了蛋白从膜上的解离.结合LipoFRET的实验结果可以推断,α-syn的解离可能是由于不同的α-syn分子膜作用位点互相竞争而导致的解离.这样的特征,可能是体内环境中影响α-syn控制其聚集的重要性质.