双抗转基因烟草纯合系的选育及田间试验

为了将双抗转基因烟草推向实用,进行了双抗转基因烟草纯合系的选育。在试验田中利用人工攻毒进行了T1代植物的抗病毒特性的分离试验;在抗性良好的T1植株的后代T2代植物上进行了田间的病毒接种试验和转基因表达的分析,从中选育出双抗转基因烟草纯合系。又于试验田中,在这些纯合系后代T3代上验证了抗病毒特性的遗传稳定性。在转基因表达分析中,发现CMV外壳蛋白基因的表达在翻译水平上受到抑制。     

高效抗虫转基因烟草的研究

苏云金杆菌HD-1的杀虫蛋白基因经5′端改造,3′端进行4种不同长度缺失后插入到含有双增强子的35S启动子,翻译增强子“Ω′”片段的双元载体中,借助土壤农杆菌LBA 4404将在此双元载体上的杀虫蛋白基因及新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)转入到生产品种烟草NC89的染色体上,从而获得了抗卡那霉素的转化再生烟草植株。用1—3龄烟青虫对这些转化植株进行大量重复虫试结果表明用4种不同长度B.t.基因转化的再生植株中都有抗虫性高的植株,其中以1.8kb的B.t.Cry IA(c)基因转化的植株杀虫效果最好,这一组转基因植株的平均杀虫率在90—100％的约占该组总虫试植株的50％。对高抗虫性植株的子一代(T1)和子二代(T2)进行遗传分析,分子生物学分析和进一步的抗虫试验表明B.t.基因已遗传到子代并初步选到了高抗虫性的转基因纯合株系D8-14和D19-8等。     

含1,3,4-口恶二唑查尔酮衍生物的设计、合成、抗病毒活性及相互作用研究

烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)是一种常见的植物病毒,能侵染多种农作物,给农业生产造成了巨大损失.本文以查尔酮为先导结构,设计合成了26个新型的含1,3,4-噁二唑查尔酮衍生物,活体抗病毒活性测试表明该类化合物对烟草花叶病毒具有较高的抑制活性,其中化合物C24对TMV表现出最好的抑制活性,其EC_(50)值为20.9μg/mL,明显优于对照药剂宁南霉素(37.9μg/mL).为了初步揭示化合物抗病毒活性的作用机制,利用MST技术测定了化合物C24与TMV CP的结合能力,其解离常数K_d值为9.05μM,说明化合物C24与TMV CP强结合后制约了TMV CP自组装,进而抑制TMV病毒对寄主的侵染.     

含喹唑啉酮的查尔酮衍生物的设计、合成及生物活性研究

设计合成了25个含喹唑啉酮的查尔酮衍生物.抗病毒生物实验结果表明,(E)-3-(4-氯苯基)-6-氟-2-((2-(4-(3-(4-甲氧基苯基)丙烯酰基)苯氧基)乙基)硫代)喹唑啉-4(3H)-酮(Z12)对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)有较好的抑制活性,治疗和保护的EC50值分别为94.3和98.8μg/mL,优于对照药宁南霉素(ningnanmycin,NNM)的216.1和189.6μg/mL.透射电镜结果表明,Z12使得TMV病毒颗粒断裂,形成长短不一的棒状结构,微量热涌动实验(MST)的结果表明, Z12对烟草花叶病毒外壳蛋白(TMV-CP)结合的Kd值为(0.033±0.014)μmol/L,优于宁南霉素的Kd值[(0.106±0.024)μmol/L],说明了Z12对TMV-CP具有更强的结合力.抑菌实验结果表明,部分化合物对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, Xoo)和柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. Citri, Xac)表现出优异活性,其中(E)-2-((...     

马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。     

烟草花叶病毒的特定位点改性及应用

病毒是自然界中已知结构最简单却侵染能力极强的生物,作为一种典型的一维棒状植物病毒,烟草花叶病毒(TMV)具有单分散的形貌与尺寸(18nm×300nm)、明确的空间结构、丰富的表面化学基团,且对哺乳动物不具有致病性,已广泛应用于电子器件、传感、成像、生物医用材料的研究。本文简述了对TMV进行基因工程或化学改性的多种方法及应用进展,并主要介绍了烟草花叶病毒在生物医用材料领域的潜在应用。     

天花粉蛋白基因的克隆、序列测定及在大肠杆菌和烟草中的表达

本文利用DNA多聚酶链式反应(PCR)技术,从括楼基因组DNA中扩增并克隆了天花粉蛋白基因,核苷酸序列分析结果表明,我们克隆的是天花粉蛋白的成熟肽及N端23个氨基酸的信号的编码序列,与前人从基因组或cDNA中克隆的该基因的比较发现,其同源性为99.25％,并且证实与发表的蛋白质一级结构的序列有较大差异,将该基因克隆到大肠杆菌高效表达质粒pJLA_(502)的P_RP_L启动子下游,通过温度诱导,得到了表达产物,进一步将该基因克隆到植物中间载体pE_3的花椰菜花叶病毒35S启动子下游,应用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化系统,成功地将该基因导入了烟草基因组,获得了转基因植株,Western blotting分析结果证实,天花粉蛋白基因已在大肠杆菌和转基因烟草中表达。     

球状功能性烟草花叶病毒纳米颗粒的制备及表征

烟草花叶病毒(TMV)由于其良好的生物相容性、单分散性、多价性、低成本等优点,已作为功能材料的基本构筑单元应用于光电器件、组织工程、疫苗载体,无机纳米材料制备等研究领域。然而,相比于棒状的TMV,球状TMV纳米颗粒无核酸分子,抗环境影响能力更强,比表面积更大。本文利用蛋白质的热致变性原理,对经基因和化学改性后的棒状TMV如半胱氨酸突变体(TMV-Cys)、赖氨酸突变体(TMV-EPMK)和β-环糊精(β-CD)修饰的TMV(TMV-β-CD)进行热变性处理,探究其形成球型纳米颗粒(TMV-SNP)的能力及功能性。结果显示,改性后的TMV经历热变性后可得到形貌均一的球型纳米颗粒,且其暴露在纳米颗粒表面的功能基团Cys、Lys和β-CD仍具有反应活性。     

一维棒状烟草花叶病毒的自组装及其应用

烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)是人类最早发现的一种植物病毒。由于其独特的一维棒状结构、在纳米尺度下的单分散特性、良好的生物相容性、易于基因修饰和化学修饰等特点,近年来,TMV在自组装以及制备生物纳米复合材料等领域受到越来越多的关注。本文主要对TMV的结构特点、在自组装领域的研究进展以及在制备生物纳米复合材料的研究现状进行详细介绍并展望了其发展前景。     

5-胺基-1-(3-氯-2-吡啶基)-4-(5-甲硫基-1,3,4-口恶二唑-2-基)-吡唑衍生物的合成及抗烟草花叶病毒活性研究

针对烟草花叶病毒(tobacoo mosaic virus,TMV),设计、合成了一系列5-胺基-1-(3-氯-2-吡啶基)-4-(5-甲硫基-1,3,4-噁二唑-2-基)-吡唑衍生物.初步抗TMV活性测试结果表明,大部分化合物对TMV表现出良好的治疗活性,其中化合物T_2、T_(11)和T_(13)在500μg/mL的浓度下,对TMV的治疗活性分别达到58.5%、56.1%和51.2%,略优于对照药剂宁南霉素(51.0%).进一步活性测试表明,化合物T_(11)对TMV的治疗活性的半数有效浓度(EC_(50))值为268.2μg/mL,与宁南霉素(247.2μg/mL)相当.活性化合物T_(11)与TMV外壳蛋白(TMV CP)作用的微量热泳动实验和荧光光谱实验均表明,该化合物与TMV CP之间具有较强的相互作用.     

微流控振荡流反转录聚合酶链式反应快速检测烟草花叶病毒

建立了一种基于毛细管的振荡流反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的微流控装置检测烟草花叶病毒(TMV)的新方法.根据TMV移动蛋白基因设计一对PCR引物,对粗提纯TMV颗粒直接进行RT-PCR.用0.025%小牛血清蛋白(BSA)对反应毛细管内壁进行静力学和动力学钝化,提高了PCR效率.在此微流控装置上进行RT-PCR,流速为70 μL/min时, 检出限为0.01 μg cDNA;可以在17 min内成功扩增出179 bp的目的DNA片段.     

水稻种子贮存蛋白Prolamin 4a基因的组织特异性表达调控

本文分离了水稻中花8号种子贮存蛋白Prolamin基因的5′端调控区域,对其DNA的全序列结构作了分析,表现启动子DNA的典型序列结构。构建了GUS融合基因,利用农杆菌LBA4404双元载体系统转化烟草,分子杂交获得转基因烟草植株,在转基因烟草开花20天时,对烟草种子作GUS基因表达的组织化学分析。实验结果表明Prolamin基因的启动子在种子的胚乳中激活下游GUS基因的表达,这是水稻Prolamin基因5′端调控序列功能的首次报道。     

Ti T—DNA基因在天仙子+烟草体细胞杂种培养细胞中的导入、表达及再生

携带章鱼碱型Ti质粒和胭脂碱型Ti质粒的根癌农杆菌不同菌株分别与天仙子+烟草体细胞杂种培养细胞经共培养离体转化程序后,Ti T-DNA基因在受体细胞中获得了转移与表达。虽然细菌处理对受体细胞的植板率具有一定的影响,但其激素自主型频率为33.9—76.8％,表现冠瘿碱合成酶活性的频率为9.7—47.5％。从转化细胞克隆再生的苗不易长大、难于生根,且其基部产生大量的次生瘤组织。在这种再生苗的叶组织及次生瘤组织中仍可检测到相应冠瘿碱合成酶的活性。     

核酶的体外合成及其对烟草叶病毒RNA靶的作用

通过微机对烟草花叶病毒(TMV)RNA二级结构的分析并参照烟草环斑卫星病毒(sTobRV)的锤头型(hammer head)催化性RNA(即ribozyme或核酶)序列,我们在体外分别合成了以TMV移动蛋白(MP)基因区域正链和负链及正链3’末端序列为靶的锤头型核酶RZ1,RZ3和RZ2。体外结果表明,RZ1在50,37和30℃都能切割含有其靶序列的体外转录TMV RNA BT1(+)和BT2(+);与之相比,RZ3在50,37和30℃都只能部分切割靶RNA BT2(-)。至于RZ2,它对TMV正链3’末端内的靶序列的任何切割作用则未能观察到。我们在核酶RZ1的催化序列的茎环内或其3’末端引入了一个起稳定作用的序列CUUCGG以观察该序列对核酶的影响,实验表明这种修饰并不改变核酶的作用效率。     

转基因烟草TMV-CP定性标准样品的研制

研制了实验室检测转基因烟草TMV-CP品系定性标准样品,并获得了国家标准样品证书.研制内容包括标准样品的制备、最小取样量、均匀性和稳定性评价.首次采用G-S指数法评价定性标准样品的均匀性及最小取样量,比传统方法使定性标准样品的均匀性评价更具科学性,可靠性.     

一种基于分子信标荧光探针快速检测烟草花叶病毒的新方法

研究了一种利用新型荧光探针——分子信标进行植物病毒检测的方法，可以不要求对病毒RNA进行严格的分离和纯化，就能快捷地得到检测结果。此方法被用于烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)基因组RNA的检测，为植物病毒分子生物学的研究提供了新的手段。     

人α-干扰素cDNA在转化的烟草植株中表达

本试验成功地将人的α-干扰素cDNA导入烟草细胞中,并得到了产生活性干扰素的转化烟草植株。将人的α-干扰素的cDNA通过平头末端连接的方法插入到植物表达质粒pAP2034中的T-DNA转录子1的启动子及其转录子7的加尾信号间的BamHI位点,构建了重组质粒piG3031,将此重组质粒导入Ti质粒载体pGV3850的T区,利用农杆菌感染叶盘的方法转化普通烟草1551,得到了抗卡那霉素的转化植株。DNA的Southern杂交表明:人的α-干扰素基因随同T-DNA一起整合进了烟草基因组中,新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NPTⅡ)的检测表明:转化植株之所以能抗卡那霉素是因为NPTⅡ酶基因表达的缘故。而干扰素的生物活性检测的结果说明转化植株能产生有活性的α-干扰素。     

中国南瓜曲叶病毒:一个双生病毒新种

本文报道了中国南瓜曲叶病毒(SqLCV-C)外壳蛋白(CP)基因PCR、克隆和序列分析,在分子水平上证实中国南瓜曲叶病毒与美国南瓜曲叶病毒(SqLCV-E)不同,是一种新的粉虱传播的双生病毒,并与印度木薯花叶病毒(ICMV)有较近的亲缘关系。     

以β-半乳糖苷酶为标记选出高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的天坛株重组痘苗病毒

我们从天坛株痘苗病毒的基因组中,分离编码11K及25K蛋白的双向转录启动子,以胸苦激酶(TK)基因为旁侧序列,插入到质粒pAT153中,构建成可以同时表达两个外源基因的载体质粒,并将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因及大肠杆菌的β-半乳糖苦酶(LacZ)基因,插入该载体质粒,使它们分别在11K及25K启动子钠控制下,构建成共表达质粒。用钙沉淀法将此质粒DNA同天坛株痘苗病毒在细胞内进行同源重组,在含X-gal的培养基挑蓝色蚀斑,简便、准确地选出重组痘苗病毒。所选到的重组痘苗病毒高效表达了HBsAg。我们还把上述重组痘苗病毒接种动物,观察了它们的毒力及免疫原性。     

人尿激酶原在CHO细胞中的基因扩增与高效表达

本文通过基因共转染和基因共扩增方法,在SV40病毒晚期启动子控制下成功地在中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-DHFR~-)中高效表达了人尿激酶原,其表达水平在5×10~(-6) mol/L氨甲喋呤存在下可达2—3μg/10~6细胞/24 h。采用PMA诱导可将表达水平提高至3.5—4μg/10~6细胞/24 h。相应的Pro-UKcDNA在细胞基因组上整合的拷贝数为200—300拷贝/细胞。Western blot分析表明,表达出来的重组Pro-UK与天然Pro-UK具有相似的分子量:S_(2444)测活法证明重组Pro-UK具有体外酰胺水解活性。