新型"三明治"结构DNA电化学传感器对急性早幼粒细胞白血病相关融合基因的检测

基于急性早幼粒细胞白血病(APL)中PML/RARα融合基因的碱基序列,设计了新型的锁核酸(LNA)修饰寡核苷酸作为捕获探针和信号探针,研究出一种基于"三明治"传感模式的电化学生物传感器对PML/RARα融合相关基因进行检测.靶序列分别与捕获探针和信号探针杂交后形成"三明治"结构.将修饰电极置于含有底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢的测定溶液中,用计时电流法检测靶序列.结果表明,该传感器可定量识别和检测溶液中人工合成的短链APL PML/RARα融合基因片段.经过条件优化,杂交前后电流值与靶标链浓度在1.0×10~(-12) ～2.5×10~(-11) mol/L范围内呈良好的线性关系,检出限为8.5×10~(-13) mol/L.该方法简单、特异性好,有望用于实际样品的检测.     

一次性信号放大电化学阻抗RNA传感器研究

以自制的丝网印刷碳电极(SPCE)为基体电极,利用DNA四面体纳米探针和酶催化信号放大构建了一个一次性电化学阻抗型RNA传感器.固定在AuNPs修饰的SPCE表面的DNA四面体结构能确保DNA探针具有可控的密度和方向,结合辣根过氧化物酶(HRP)催化H_2O_2氧化4-氯-1-萘酚(CN)的反应,生成不溶物沉积在电极表面,有效地放大电化学阻抗信号,实现了miRNA的高灵敏阻抗测定.检测限可以低至1.0 pmol/L,阻抗值和miRNA-141浓度的对数在3.0～1 000 pmol/L之间具有良好的定量关系.     

基于羧基化聚吡咯-氯化血红素和点触发链置换反应信号放大的电化学生物传感器检测转基因作物中CaMV35S序列

为适应快速增长的转基因生物(GMOs)安全评价与管理的需求,高效、可靠的转基因检测技术研究与应用的重要性日益凸显。该文采用一步法合成了羧基化聚吡咯(cPPy)与氯化血红素(Hemin)的纳米复合物(cPPy-hemin),并以其为信号标签合成了一种DNA双链结构功能化的纳米信标(DNA-cPPy-hemin)。利用cPPy-hemin增强的模拟酶催化活性,结合点触发链置换反应(TSDR)信号放大策略,制备了一种新型电化学基因传感器用于转基因成分的灵敏检测。通过信号探针(Ps)与模板链(Ts)、辅助链(As)结合形成DNA双链体结构中的-NH2功能化cPPy-hemin,制备Ts/As/Ps-cPPy-hemin双链DNA结构的纳米信标。在目标花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)序列和燃料链(Fs)存在下,TSDR过程释放出的Ps-cPPy-hemin与固定在电化学沉积金纳米粒子修饰GCE表面上巯基化的DNA捕获探针(Cs)相结合,利用cPPy-hemin对H₂O₂的模拟酶催化产生的电信号,可实现对CaMV35S的定量检测。在最优条件下...     

基于双二茂铁和β-环糊精之间主客体识别模式信号放大的均相电化学适体传感器用于凝血酶的灵敏检测

合成了双二茂铁化合物并用于修饰在凝血酶适配体(TBA)的两端作为电化学信号标记物,构建了一款基于双二茂铁与β-环糊精(β-CD)之间主客体识别原理进行信号扩增的均相电化学凝血酶传感器。当电化学TBA探针与凝血酶发生特异性结合后,TBA探针由原来的茎环结构变成"G-四链体",双二茂铁分子通过主客体识别作用进入修饰在金电极表面的β-CD的空腔内,产生了稳定的电化学电流响应信号。该凝血酶电化学均相传感器在0.02～62.5 nmol/L范围内对凝血酶呈良好的线性关系,检出限为8.4 pmol/L。该传感器对凝血酶可为凝血酶的快速检测提供了一个可行的方案。     

纳米探针芯片技术用于微量乙肝病毒DNA的检测

利用两组探针修饰的微粒:(1)表面标记有可与待测乙肝病毒(HBV) DNA另一端结合的纳米金探针1(信号探针)以及可与信号探针部分结合的纳米金探针2(检测探针);(2)表面标记有可与待测HBV DNA一端结合的磁珠探针(捕捉探针1).检测靶HBV DNA时,磁珠探针与信号探针在液相中可分别与HBV DNA靶序列一端结合最终形成三明治样结构.再以磁场将三明治样复合物从反应液中分离,以DTT溶液将信号探针从纳米金颗粒上洗脱.洗脱后的信号探针数量反映靶基因的多寡,信号探针一段与预先点样的基因芯片上的捕捉探针2结合,检测探针与信号探针另一段相结合,最后用银染液将检测探针显色从而得到靶目标DNA相对定量信息.结果表明,本检测方法的检测灵敏度达到10-15 mol/L水平.检测时间少于1.5 h,检测结果与HBV DNA水平呈现较好的线性关系且无假阳性结果;本方法有望用于乙肝病人血清中HBV DNA的快速筛测及其它微生物基因的检测.     

基于靶序列循环及DNA长距自组装的电化学传感器用于乳腺癌相关序列c-erbB2的检测

基于"核酸外切酶(ExoⅢ)辅助靶序列循环"和"DNA长距自组装"两种信号放大技术研制了一种DNA电化学生物传感器,并将其用于乳腺癌相关靶序列的高灵敏、高特异性检测。通过将发卡型探针固定在金电极表面,当靶序列存在时,在ExoⅢ的辅助下,发生杂交、酶降解、再杂交的第一重信号放大过程。接着在电极表面加入两条辅助探针,即可发生级联式杂交,形成长距超级"三明治"DNA结构。该结构可吸附大量的电活性分子六氨合钌配合物(RuHex),产生很强的电化学信号,从而实现信号的第二重放大。实验结果表明,在最佳条件下,该传感器的线性范围为10 amol/L~10 pmol/L,检出限达到8 amol/L,而且能较好地识别完全互补和错配序列,有望用于临床实际样本中超低含量靶序列的检测。     

基于纳米金复合探针-蛋白芯片检测心肌损伤标志物

运用纳米金复合探针结合蛋白芯片,建立了一种检测心肌损伤标志物的新方法.构建了2种纳米金探针:标记有检测抗体和DNA探针1的检测探针和标记有DNA探针2(与DNA探针1的碱基互补配对)的信号探针.当目的抗原存在时,检测探针经检测抗体和抗原,与芯片上捕获抗体结合固定在芯片上,信号探针通过碱基互补配对与检测探针结合使信号放大,最后利用纳米金成核原理染色,通过显微镜观察结果并定量分析.该体系在40 min内可检测多种标志物,其中肌钙蛋白Ⅰ(c TnⅠ)的检出限为10 pg/m L,与临床电化学发光法(ECLIA)灵敏度相当;肌红蛋白(MYO)与新型脂肪酸结合蛋白(HFABP)的检出限分别为640和10 pg/m L,与ECLIA及酶联免疫吸附法(ELISA)相比,灵敏度显著提高.     

基于杂交链式反应辅助多重信号放大的端粒酶灵敏检测

端粒酶是真核细胞维持端粒长度的关键逆转录酶,其生物活性的高低可以为多种癌症的临床诊断和预后治疗提供有价值的信息.本研究以人宫颈癌细胞(HeLa细胞)裂解液中的端粒酶为研究对象,通过借助杂交链式反应辅助多重信号放大策略,提出了一种新颖、灵敏的检测端粒酶电化学方法.首先将端粒酶的延伸引物自组装在金电极表面,当端粒酶存在时,端粒酶能够催化引物的延伸,产生与发卡环探针H1部分互补的序列,进而引发杂交链式反应,形成由两个发卡环探针(H1和H2)交替杂交而形成的DNA长链.由于H1和H2末端均修饰有生物素,加入链霉亲和素修饰辣根过氧化物酶后,辣根过氧化物酶被被连接到电极表面,催化邻苯二胺氧化生成2,3-二氨基吩嗪,产生显著的电化学信号.实验结果表明,本研究建立的端粒酶电化学检测方法高效、可行,线性范围宽,灵敏度高,可以检测每毫升10个HeLa细胞裂解液中的端粒酶.本方法具有较好的选择性,能有效区分端粒酶和对照蛋白.     

基于DNA四面体纳米结构探针的电化学生物传感器检测DNA甲基化

该文以DNA四面体纳米结构探针(TSP)为捕获探针,将辣根过氧化物酶标记的IgG抗体结合在纳米金颗粒表面(AuNPs-IgG-HRP)作为信号分子,构建了一种新型DNA甲基化电化学传感器。利用一步热变性法组装成TSP后,通过Au—S键固定在修饰纳米金颗粒的金电极表面,经过靶标DNA杂交、5-甲基胞嘧啶(5-mc)抗体及AuNPs-IgG-HRP结合后,用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测。采用循环伏安法(CV)和电化学阻抗谱(EIS)对修饰电极的构建过程进行电化学表征。探究了杂交时间、5-mc抗体浓度、IgG-HRP加入体积、氢醌(HQ)和过氧化氢(H2O2)浓度对传感器的影响。在最佳条件下,该传感器对甲基化DNA的线性响应范围为1.0×10-15~1.0×10-10 mol/L,检出限(S/N=3)为4.4×10-16 mol/L。该传感器具有良好的选择性和稳定性,为DNA甲基化检测提供了新方法。     

基于 G-四联体门控制效应的铅离子适配体传感器

将富鸟嘌呤(G)序列核酸适配体与门控制效应相结合,通过控制门的开关实现信号放大,构建了新型电化学生物传感器,用于铅离子(Pb2+)的高灵敏检测。首先将单-6-巯基-β-环糊精(6-SH-β-CD)自组装在金电极上,形成有序排列的分子自组装膜,且分子之间留有空隙,可作为探针通过的门结构。随后将发夹结构的富含 G 序列的核酸适配体修饰在环糊精次面端口,制得可特异性识别 Pb2+的电化学生物传感器。富 G 序列适配体结合 Pb2+后可折叠形成 G-四联体结构(G4-Pb2+),覆盖住电极表面的探针通道,产生关门效应,使探针氧化还原电流强度减小,进而形成门控制效应,利用该效应可进行 Pb2+的定量检测。门控制效应显著提高了信噪比和检测的灵敏度,在1×10-13~5×10-11 mol/ L 浓度范围内,Pb2+浓度的负对数与 DPV 响应电流呈良好的线性关系,检出限为3.6×10-14 mol/ L(DL=3δb / K)。传感器用于实际水样品中 Pb2+的测定,结果令人满意。     

基于主客体识别作用构建非固定的DNA电化学生物传感器研究

应用主客体分子识别技术构建一种无需固定DNA探针的电化学检测DNA的新方法。分别采用间甲基苯甲酸标记和金纳米颗粒标记的两段DNA探针,使用β-环糊精修饰电极对杂交结构进行识别和电化学检测。采用差分脉冲伏安法(DPV)实现对特定序列DNA的定量检测。在优化的条件下,该体系表现出良好的灵敏度和选择性,对特定序列DNA的检测限为1.8×10-13mol/L。     

基于三维有序金掺杂纳米二氧化钛的DNA生物传感器研究

用模板法在氧化铟锡(ITO)电极上制备具有三维有序多孔结构的金掺杂纳米二氧化钛修饰电极(3DOM GTD/ITO),扫描电镜(SEM)结果表明,制备的修饰电极三维结构规整有序、孔径均一。将标记有二茂铁(Fc)的DNA探针修饰到3DOM GTD/ITO电极上构建了一种新的标记型DNA生物传感器,通过Fc在DNA探针杂交前后的电化学信号变化可识别目标靶序列。采用循环伏安(CV)、示差脉冲(DPV)和交流阻抗(EIS)等方法对DNA探针在电极表面的固定和杂交进行表征。实验结果表明,该DNA生物传感器可以成功地识别乳腺癌基因靶序列,Fc的氧化还原电流与靶序列浓度在8.0×10-7～1.0×10-5 mol/L范围内呈线性关系,线性相关系数为0.9908,检测限为5.2×10-7 mol/L。     

铂纳米颗粒修饰电化学DNA传感器检测大豆中转基因成分

用电沉积方法将铂纳米颗粒修饰在玻碳电极表面,然后将花椰菜花叶病毒35S启动子ssDNA片段直接吸附在铂纳米颗粒上,制成特异的电化学DNA传感器。用扫描电子显微镜和循环伏安法对修饰铂纳米颗粒电极进行了表征。ssDNA探针与互补目的ssDNA杂交,以[Co(phen)3]3 (phen=1,10-Phe-nanthroline)为杂交指示剂,用方波伏安法进行检测,表现出良好的响应信号。与在裸玻碳电极上修饰的探针相比,测定目的基因的灵敏度显著提高。传感器对互补目的ssDNA检测的线性范围为2.14×10-9～2.14×10-7mol/L;检出限为1.0×10-9mol/L,与3个碱基错配的DNA序列杂交,观察不到明显的杂交信号。样品DNA经HindⅢ非限制性内切酶酶切后测定,杂交检测信号增大。用传感器检测含量不同的转基因大豆DNA和非转基因大豆DNA的混合溶液,杂交前后的电流差与转基因DNA的含量呈良好线性关系。连续5次测量含有100%转基因大豆DNA杂交后的电信号,相对标准偏差为5.89%,固定探针的电极再生后可重复使用8次。     

N-二(苯-二氨基甲酰基)甲基磷酸及其铕(Ⅲ)配合物的合成及在DNA电化学传感器中的应用

合成了一种新的含磷有机三足体衍生物N-二(苯-二氨基甲酰基)甲基磷酸及其铕(Ⅲ)配合物,通过元素分析、红外光谱、差热-热重等方法对其进行结构表征和组成分析,并以该配合物为杂交探针,对其电化学传感器进行较为系统的研究。结果表明:此配体与Eu(Ⅲ)离子倾向于形成1∶1型配合物;紫外光谱法和循环伏安法的研究结果显示,铕(Ⅲ)配合物与DNA以插入形式发生相互作用。将该配合物作为杂交探针进行DNA电化学传感器研究时发现,该配合物在修饰单链DNA的电极检测作用下,无明显的电化学信号响应。而当将其用于检测杂交双链DNA时,出现了明显信号。基于该配合物的DNA传感器对互补序列、错配序列及非互补序列有良好的选择作用。     

基于链替代信号放大灵敏检测端粒酶活性的电化学方法

利用标记二茂铁基团的DNA(T-DNA)分子作为信号探针, 基于端粒酶特异性延长其底物链(TS)所引发的链替代反应, 建立了一种检测端粒酶活性的电化学信号放大法. 将巯基化的发夹型DNA分子(H-DNA)通过金-硫键自组装于金电极表面, 辅助DNA(A-DNA)与二茂铁修饰的T-DNA部分互补杂交形成双链AT-DNA; 当端粒酶存在时, 可在TS的3′末端合成TTAGGG的重复序列; A-DNA与TS延长链杂交置换出T-DNA; T-DNA与发夹H-DNA杂交使得二茂铁靠近电极表面; 一条TS延长链可以释放出多条T-DNA, 将二茂铁富集到金电极表面, 从而实现信号放大检测端粒酶活性. HeLa细胞个数在5~100范围内与电流值成正比, 最低可检测5个HeLa细胞中端粒酶的活性. 因此, 本文建立了一种简单灵敏检测端粒酶活性的电化学方法.     

基于层层组装技术的超灵敏无标记电化学适配子生物传感器对蛋白质的检测研究

适配子由于其对目标靶分子的选择性高,亲和力强,且具有易体外合成与修饰并可以反复变性复性等特性,被广泛的用于生物分子的识别和检测上.由于蛋白质大的分子量和高的电荷密度,一旦当它们被固定到电极表面,便会引起较大的电化学信号的改变.大多数的无标记电化学检测是利用电化学交流阻抗法(EIS),使用的电化学探针一般存在于电解质中,而用伏安法测定来自电极表面的电化学探针的无标记适配子传感器却很少见.传统的层层组装(LBL)技术可以简单方便的实现电极表面探针的修饰与固定.     

基于β-环糊精主客体识别作用的均相DNA杂交电化学生物分子识别研究

基于β-环糊精(β-CD)和间甲基苯甲酸(mTA)的主客体识别,建立了均相DNA杂交电化学生物传感技术。将主体分子β-CD通过电化学聚合的方法固定在氮乙酰基苯胺修饰的玻碳电极表面,同时将mTA通过酸胺缩合反应标记在探针DNA序列上,与目标DNA在溶液均相中杂交之后,用修饰好的电极对探针DNA上的mTA进行主客体识别。以两种嵌入剂作为电化学指示剂——亚甲基蓝(MB)和道诺霉素(DNM),证实了方法的可行性。MB的电化学信号与完全互补DNA浓度在2.0×10"12～2.0×10"10mol/L之间呈良好线性关系,检出限为7.6×10"13mol/L;DNM的电化学响应与完全互补DNA浓度在1.0×10"12～1.0×10"9mol/L之间呈良好线性关系,检出限可达6.0×10"13mol/L,并表现出良好的重现性和稳定性。     

基于酶辅助的比率型电化学适配体传感器用于前列腺特异性抗原检测

基于核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)辅助靶标循环策略,构建了比率型电化学适配体传感器,并用于前列腺特异性抗原(PSA)的检测。利用亚甲基蓝(MB)作为内置参考信号,当PSA存在时,发夹探针1(HP1)的适配体序列与PSA特异性结合,引起ExoⅢ的2次切割过程,从而实现2次循环扩增反应,导致电极上更多的MB标记的发夹探针3(MB-HP3)被切割;再加入二茂铁(Fc)标记的DNA链(Fc-DNA)与MB-HP3酶切后的片段进行杂交;最终,Fc的信号(I_Fc)增加,而MB的信号(I_MB)基本保持不变。在最佳条件下,I_Fc/I_MB与PSA浓度的对数值在0.001～100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,检出限为0.24 pg/mL。该传感器在临床实际样品检测中具有较好的应用前景。     

基于酶辅助靶标循环的适体传感器灵敏检测中药中黄曲霉毒素B1

该文基于酶辅助靶标循环信号放大策略构建了用于黄曲霉毒素B1(AFB1)高灵敏检测的化学发光适体传感器。以G-四链体/氯化血红素DNA酶为信号分子设计了免标记的适体探针H1-S1和发夹探针H2。适体探针结合目标AFB1,在核酸外切酶I辅助下,触发靶标循环反应产生发夹H1。发夹H1与H2杂交,释放出完整的G-四链体序列,并进一步与氯化血红素结合形成G-四链体/氯化血红素DNA酶。DNA酶通过催化氧化鲁米诺-H2O2化学发光体系产生化学发光信号,实现AFB1的放大检测。在最优实验条件下,化学发光强度与AFB1质量浓度的对数在0.001~100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(r2)为0.9955,检出限为0.93 pg/mL,回收率为93.7%~107%。该适体传感器操作简单、灵敏度高、特异性好,在黄曲霉毒素污染检测方面具有良好的应用前景。     

寡聚酰胺为探针的电化学DNA生物传感器

DNA分子中的碱基对可以长程传递电荷, DNA分子中的碱基π堆积结构为电荷的长程传递提供了良好的通道. 电荷在DNA分子中的传递受碱基序列的影响, 利用这种性质可以构建DNA碱基错配检测的电化学传感器. 寡聚酰胺能和DNA以小沟绑定方式高亲和力地结合, 并且具有序列识别功能, 本文以带有硝基官能团的寡聚酰胺分子为电化学探针, 设计了电化学DNA生物传感器. 结果显示, 寡聚酰胺与DNA修饰电极作用后, 电化学响应显著增强, 并且可以作为检测DNA碱基错配的电化学探针分子.