基于液相色谱-串联质谱法的肉类特征肽段鉴别及掺假测定

建立了液相色谱-串联质谱技术鉴别肉类特征肽段及定量检测羊肉中常见外源肉掺假的方法。样品经蛋白质提取、胰蛋白酶水解和固相萃取小柱净化后,利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q/Exactive-HRMS）和Proteinpilot软件,实现蛋白质和多肽的鉴定;再通过基本局部比对搜索工具（BLAST）与Uniprot数据库对比分析,筛选出羊肉、鸭肉、猪肉和鸡肉的20个物种特征性多肽标志物;最后利用高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-QqQ-MS）系统对羊肉、鸭肉、猪肉和鸡肉的特征性多肽进行了验证和多反应监测（MRM）定量研究。将鸭肉、猪肉和鸡肉分别按照质量分数为1%、5%、10%、20%、50%的比例掺加到羊肉中,得到鸭肉最低掺假检出限为0.25%、猪肉最低掺假检出限为0.17%、鸡肉最低掺假检出限为0.10%。     

高效液相色谱-串联质谱法测定肉制品和调味料中7种水产品过敏原

基于高效液相色谱-串联质谱系统建立了食品中水产品过敏原的快速筛查和定量检测方法。样品经蛋白质提取、纯化、胰蛋白酶解后，利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q/Exactive-HRMS）结合ProteinPilot软件，基于母离子和碎片离子谱分析，实现蛋白质和多肽的鉴定。再通过基本局部比对搜索工具（BLAST）与Uniprot数据库对比分析，筛选出南美白虾、大闸蟹、青蟹、金枪鱼、大西洋鲑鱼的7种过敏原蛋白的30个特征肽。利用高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-QqQ-MS）系统对特征肽进行验证和多反应监测（MRM）定量研究。结果表明，该方法在5~250 mg/kg范围内线性关系良好，检出限为2~3.5 mg/kg，平均回收率为88.7%~110.2%。该方法重现性好，通量高，可应用于肉制品和调味料中7种过敏原的快速筛查和定量分析。     

人血清内源性多肽无标记定量分析新策略

多肽组学(Pepti domics)以其在疾病标志物发现中所起的重要作用正受到越来越多的关注.然而,目前尚缺少针对多肽组学的高效定量方法.本文建立了一种基于纳升液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用(μLC-Q-TOF-MS/MS)系统的色谱峰面积无标记多肽定量方法.该方法首先对两组样品中的多肽进行相对定量,然后选取相对量大于2或小于0.5的多肽,用纳升液相色谱与串联二级质谱(μLC-MS/MS)的选择性数据依赖模式(DDA)进行序列鉴定.将不同量标准样品牛血清白蛋白(BSA)酶解液加入到相同量的正常人血清样品中,然后用该方法进行定量分析,得到的定量结果平均相对偏差为6.42%.该方法分别被用于健康人血清与肝细胞癌(HCC)以及乳腺癌病人血清中内源性多肽的定量比较分析,并成功鉴定了血清中一些与HCC和乳腺癌相关的内源性多肽.由于Q-TOF-MS/MS的高分辨率和宽质量检测范围,价态高达+5和分子量超过4000的多肽也可被可靠地进行定性和定量分析.实验结果进一步表明在多肽组学分析中μLC-Q-TOF-MS/MS比传统的MALDI-TOF-MS具有更高的检测灵敏度.     

超高效液相色谱-串联质谱法测定乳与乳制品中牛乳铁蛋白

建立了超高效液相色谱-串联质谱技术定量检测乳制品中牛乳铁蛋白含量的方法。样品经脱脂、酶解后,利用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-Q/Exactive-HRMS）和Protein Pilot软件分析,实现了乳铁蛋白及其肽段的鉴定;通过初级局部序列搜索工具（basic local alignment search tool,BLAST）与Uniprot数据库对比分析筛选出牛乳铁蛋白的8个特征肽段;选择其中3个响应强度高、稳定性好的特征肽段进一步通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-QqQ-MS）进行验证和多反应监测（MRM）定量研究,并考察了空白基质匹配的外标法和内标法对乳铁蛋白检测结果的差异。采用外标法定量时,3个肽段在各自范围内线性关系良好,检出限为0.023~0.041 mg/kg,定量限为0.077~0.137 mg/kg,平均回收率为93.8%~103.9%,日内精密度≤8.8%,日间精密度≤9.5%。该方法抗干扰能力强,灵敏度高,重复性好,适用于乳及乳制品中牛乳铁蛋白的含量测定。     

超高效液相色谱-串联四极杆质谱法测定水产品中氯霉素残留量

建立超高效液相色谱-串联四极杆质谱法测定水产品中氯霉素残留量的方法。样品均质后经乙酸乙酯提取,正己烷脱脂(或用固相萃取柱净化),超高效液相色谱分离,串联四级杆质谱检测,同位素内标法定量。方法在0.05～1.0μg/kg的添加范围内的平均回收率为84.9%～103.3%,相对标准偏差为3.2%～5.2%,定量检测限为0.02μg/kg。方法适用于各种水产品基质的氯霉素残留检测。     

血清多肽组及其个体差异的纳升液相色谱-高分辨串联质谱分析

分析和比较疾病组及健康对照组的混合样品是血清多肽组生物标记物研究的常用方法,但对健康个体多肽组的差异和共性关注较少.本研究利用纳升液相色谱-高分辨四级杆飞行时间质谱鉴定健康人混合血清样品(20例)的多肽组,阐明血清多肽组的分子量分布等一般特征,进而选取6例个体样品单独分析并与混合样品的分析结果进行比较,说明正常健康样品之间的个体差异和共同成分.结果表明,可鉴定序列的血清多肽组的分子量范围在7000 Da以下,纤维蛋白原α链等蛋白质所属肽段的检出频率最高,肽段在蛋白质水平上分布具有不均一性,排在前10％的蛋白质占据了约50％的总肽段,而后40％的蛋白质只有1条检出肽段.此外,在所有样品中都检测到了来自于8个蛋白质的12个共同肽段,检测到了N端乙酰化、氨基酸氧化、磷酸化、脱氨化和脱水等翻译后修饰和明显的阶梯序列现象.本研究在肽段序列水平分析了血清多肽组的基本特征和个体差异,可为血清多肽组生物标志物研究提供参考.     

固相萃取-液相色谱/质谱联用法测定猪肉中3种多肽类抗生素

建立了猪肉中万古霉素、去甲万古霉素和杆菌肽A 3种多肽类抗生素的正压驱动固相萃取法结合超高效液相色谱串联三重四极杆质谱(UHPLC-MS/MS)检测方法。猪肉样品经提取后正己烷脱脂,采用Pharma FF C_(18)固相萃取小柱正压驱动净化,洗脱液无需浓缩直接进行LCM S/M S分析,使用0.1%甲酸水溶液和乙腈分别作为流动相进行梯度洗脱,采用溶剂共进样方式分析,ESI正离子模式,前体离子均为双电荷离子,多反应监测(MRM)模式检测,外标法定量。结果表明,3种多肽抗生素采用基质加标曲线定量,在0.5~100μg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.999,方法定量限为0.40~0.70μg/kg;加标回收率在72.9%~82.0%之间,相对标准偏差(RSD)为2.6%~14%。方法适用于猪肉中3种多肽类抗生素的同时测定。     

亲水相互作用色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测奶粉中的氟乙酸钠

基于亲水相互作用色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱系统,建立了奶粉中氟乙酸钠的快速筛查和定量检测方法。奶粉样品用水溶解后经正己烷脱脂,用6 mol/L硫酸调节pH值,经乙腈提取后用亲水相互作用色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱进行分析。结果表明,该方法在1~50 μg/kg范围内线性关系良好,定量限为1 μg/kg,平均回收率为85.5%~106%,相对标准偏差为5.20%~13.6%。该方法可用于配方奶粉、脱脂奶粉和乳清粉等奶粉产品中氟乙酸钠的快速筛查和定量分析。     

超高效液相色谱-串联质谱法鉴定猪肉的特异性肽生物标志物

以亲缘关系较近的猪、牛和羊3个物种的肌肉组织为研究对象,采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS),筛选并确认了猪物种肉特异性肽生物标志物.3种纯肉样品经蛋白质提取、胰蛋白酶消化和UPLC-TripleTOF-MS分离鉴定,得到的总离子流图谱(TIC)与Uniprot蛋白质数据库对比分析,筛选出3个物种肉的3种高丰度同源蛋白和8种潜在的肽生物标志物;潜在的肽生物标志物经QTRAP-MS质谱的多反应模式(MRM)分析,最终确认了猪物种肉的5种肽生物标志物,其中3种肽生物标志物未见文献报道.     

超高效液相色谱-串联质谱联用法对奶粉中3种硝基咪唑残留物的测定

建立了超高效液相色谱-串联质谱联用法测定奶粉中甲硝唑(MNZ)、二甲硝唑(DMZ)和洛硝哒唑(RNZ)3种硝基咪唑类残留物的方法。样品以乙酸乙酯和乙腈提取,正己烷脱脂,浓缩过滤后进行超高效液相色谱-串联质谱分析,多反应监测正离子模式扫描。实验优化了质谱条件,并考察了方法的灵敏度、准确度、精密度和回收率。甲硝唑、二甲硝唑和洛硝哒唑的线性范围为2.5~100.0μg/L,定量下限均为2.5μg/kg,在2.5、5.0、10.0μg/kg 3个水平的加标回收率为89%~112%,相对标准偏差为4.0%~7.1%。该方法简捷、灵敏度高,可用于奶粉中硝基咪唑残留的检测。     

基于高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱指纹图谱的功能性婴幼儿奶粉甄别新策略

应用高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱(HPLC-Q-TOF-MS)联用技术建立了婴幼儿奶粉的指纹图谱。用主成分分析法校正模式找出功能性婴幼儿奶粉和普通婴幼儿奶粉指纹图谱的差异。通过t检验选取潜在的生化标志物,结合数据处理软件推断可能的蛋白来源,并采用液相色谱-质谱联用技术,对验证样品进行标志物的可靠性验证。结果表明:功能性婴幼儿奶粉的潜在标志物有14种,可能的来源分别为αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白和β-酪蛋白。由此可推测功能性婴幼儿奶粉中有蛋白的水解产物存在,这些标志物可以有效地将功能性婴幼儿奶粉和普通婴幼儿奶粉区分。     

基于多肽标记物分析的肉制品掺伪定量检测技术

该文开发了一种基于多肽标记物分析的肉制品掺伪检测技术,可同时进行定性和定量分析。样品经蛋白质提取和胰蛋白酶消化后,采用高分辨质谱(HRMS)和生物信息学工具,寻找牛、鸡、鸭、猪和羊5种肉类的特异性热稳定多肽标记物。在多反应监测(MRM)模式下,通过高效液相色谱-串联四极杆质谱(HPLC-QQQ-MS)对这些标记物进一步验证。使用由两种不同质量分数的肉类混合物(0%~100%)建立定量校准曲线,测定低限可达1%。采用该方法对市售的实际样品进行测试,验证结果表明该方法是一种可靠、有效的肉制品鉴定手段,可同时用于生肉和熟肉掺伪的定量检测。     

超高效液相串联质谱法检测牛肉中的马肉

利用超高效液相串联质谱法(UPLC-MS/MS)对牛肉中牛血清白蛋白(BSA)和马肉中马血清白蛋白(ESA)经胰蛋白酶消化后的目标肽进行鉴定,采用多反应监测(MRM)方法对结果进行验证,建立了一种检测牛肉中掺杂马肉的方法.对UPLC-MS/MS数据的深入研究表明,共检测到9个牛特异性多肽和17个马特异性多肽.其中DAFLGSFLYEYSR(m/z 784.3,Charge 2+)和ADFAEVSK(m/z 433.7,Charge 2+)的质谱响应最好,被选为牛肉和马肉定量的靶肽.所建方法在5.5～550.0和4.875～487.5 mg/L范围内线性关系较好(r~20.99),检测限、选择性、精密度、回收率和稳定性完全满足分析要求.     

基于超高效液相色谱-八端口转子阀的微升级预分级系统的建立

复杂生物系统蛋白质组的深度覆盖鉴定得益于近年来快速发展的高效色谱分离和串联质谱分析技术。二维高效液相色谱（2-D HPLC）是实现复杂肽混合物正交分离的有效手段，但其缺点是运行时间长，通常要求肽上样量在毫克级别，且收集时的组分体积大，后续合并流程复杂，而有望替代其的StageTip技术，则由于有限的色谱分离梯度，难以达到充分的正交分离。该文探索了超高效液相色谱（UPLC）和八端口转子阀联用，作为高效、便捷肽段预分离和收集系统的可行性。研究结果显示，将UPLC的高pH反相色谱分馏与在线LC-MS/MS相结合，可以实现高pH和低pH条件下基于肽段不同色谱保留行为的正交互补分离，在蛋白质鉴定方面表现出优越的性能。应用该方法对人肝癌细胞系HepG2进行3次技术重复试验，重复试验间具有非常高的定量重现性（决定系数R²>0.95）。与传统StageTip方法相比，肽段鉴定数提高了23.52%。该分级方法灵活、稳定，能够针对较少的样品开展蛋白质组深度覆盖分析。     

固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法检测梨树叶中熊果苷

建立了固相萃取净化、超高效液相色谱-串联质谱检测梨树叶中熊果苷含量的方法.将粉碎的梨树叶样品用甲醇提取,ENVITM-18固相萃取柱净化,超高效液相-电喷雾串联四级杆质谱检测,外标法定量.测定时用 Acquity UPLC HSS T3 色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm)分离,甲醇-水(V/V,7+93)洗...     

超高效液相色谱-串联质谱法对奶制品中苯甲酸雌二醇残留的测定

建立了测定牛奶和婴儿配方奶粉中苯甲酸雌二醇的超高效液相色谱-串联质谱方法.样品前处理采用酶解、甲醇提取,经C18和NH2基固相萃取柱净化后,苯甲酸雌二醇由超高效液相色谱-串联质谱分离,并在正离子电离模式和多反应监测模式下,用基质匹配标准校正方法补偿基质效应,以氘代诺龙-d3为内标进行定量检测.牛奶和婴儿配方奶粉中苯甲酸雌二醇的检出限分别为0.07、0.39 μg/kg,定量下限分别为0.2、0.95 μg/kg.在4、10 μg/kg加标水平下,牛奶和婴儿配方奶粉中苯甲酸雌二醇的回收率为76% ～90%,相对标准偏差为5.0% ～15.2%.     

疑似蛇毒液样品的纳升级超高效液相色谱-高分辨质谱分析鉴定

针对5个疑似蛇毒毒液及其沾染样品,基于纳升级超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（Nano LC-MS/HRMS）技术,结合尺寸排阻色谱分离,建立了一种蛋白质种类及物种归属的严格鉴定方法。5个样品经尺寸排阻色谱分离后均得到3个洗脱峰,分别冻干后以胰蛋白酶进行溶液内酶解处理并进行液相色谱-高分辨质谱分析鉴定。首先采用全扫描-数据依赖型MS/MS（Full MS/dd MS²）采集模式对样品中的肽段信息进行非靶向采集,依次与Swiss-Prot、蛇亚目（Serpentes）、游蛇科（Colubroidea）、眼镜蛇科（Elapidae）、眼镜蛇亚科（Elapinae）、眼镜蛇属（Naja）蛋白质数据库逐级收缩比对;再筛选符合肽谱匹配度、肽段错误发现率小于1%和特征肽段数目大于等于2的蛋白质,共鉴定到32种蛋白质均来自中华眼镜蛇（Naja atra）,可归属于Naja atra的10个家族,主要为三指毒素、金属蛋白酶、磷脂酶A2等。最后,采用平行反应监测模式选取每种蛋白质的两条特征肽段进行靶向验证,当两条特征肽段均满足“至少75%的y⁺和b⁺离子的Δm/z小于5 ppm”时,方认为鉴定到了样品中的某一蛋白质。最终鉴定出5个样品均含有Naja atra蛇毒。此鉴定方法研究系统、严格,可为蛇毒中毒司法鉴定以及毒药物研究等提供有效的技术支持。     

反相高效液相色谱-电喷雾质谱法分析食源血管紧张素转换酶抑制肽

利用反相高效液相色谱/电喷雾离子阱质谱法,直接分析从牦牛乳酪蛋白中酶水解得到的血管紧张素转换酶抑制肽粗产物。RP-HPLC显示具有活性的多肽粗产物含有3个主要成分,质谱同步测定各组分的分子量(m/z)分别为815.2,1680.1,962.2,然后选择[M H] 离子通过串联质谱(MS/MS)得到碎片离子,利用b离子和y离子互补的方法鉴定了多肽序列。三条肽分别为Leu-Pro-Tyr-Tyr,Pro-Leu-Pro-Leu-Leu-Gln,Phe-Leu-Pro-Pro-Tyr-Tyr。结果显示,所获得的多肽序列与牛乳酪蛋白一级结构中相应肽段的序列一致。     

高效液相色谱-质谱法测定牛Ⅰ型胶原含量

建立了一种基于高效液相色谱-质谱联用技术并通过特征多肽进行牛Ⅰ型胶原含量检测的方法。胶原海绵样品经酶解处理后进行色谱分离,在电喷雾离子源正离子扫描及保留时间依赖的单离子监测模式(SIM)下测定,外标法定量。采用胰蛋白酶特异性酶解得到牛Ⅰ型胶原的1个特征多肽为GFSGLDGAK。该多肽在0.645～21.5μg/mL质量浓度范围内线性关系良好(r~2=0.999 4);方法的定量下限为6.45×10~(-4)μg/mL;在3.10、2.48、1.55μg/mL 3个加标水平下,平均回收率为98.2%～102%;峰面积的相对标准偏差(n=6)为0.80%。胶原海绵样品经均匀性、稳定性和定值检测,确保了方法有效性,验证了该产品质量,且测得牛Ⅰ型胶原含量为(0.926±0.014) mg/mg。该方法简便快速,重现性好、稳定性高,可有效地对牛Ⅰ型胶原进行定量。     

高效液相色谱法测定鸡组织中苯并咪唑类药物残留标志物

建立了高效液相色谱同时测定鸡肉、鸡肝脏和鸡肾脏中11种苯并咪唑类药物残留标志物的方法。样品采用乙腈提取，经正己烷脱脂后以MCX固相萃取小柱净化，净化液浓缩处理后采用Atlantis T₃色谱柱分离，以甲醇-1%（v/v）乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，紫外检测波长为292 nm，外标法定量检测。目标化合物在25~1000 μg/L范围内线性良好，定量限为50 μg/kg；在不同添加水平下目标化合物的回收率为70.91%~103.21%，相对标准偏差为1.48%~10.08%（n=6），精密度和准确度均符合要求，能够满足鸡组织中苯并咪唑类药物残留标志物的检测要求。