酶切过程中肽段过烷基化对蛋白质定性和定量分析的影响

蛋白质的还原-烷基化是蛋白质酶切中的重要步骤,常用的烷基化试剂是碘乙酰胺(IAA),但是IAA除了和半胱氨酸发生反应,也可能和其他多种氨基酸发生副反应。我们模拟常规的酶切条件,系统地研究了蛋白质真实酶切时所有酶切肽段发生烷基化的情况。结果表明,多种氨基酸可以发生烷基化,其趋势为:半胱氨酸>肽段N端氨基酸>天冬氨酸>谷氨酸>组氨酸>天冬酰胺>赖氨酸>酪氨酸,同时也发现同一肽段上的氨基酸烷基化具有排他性和聚集性。根据定性结果,采用质谱多反应监测(MRM)技术对多个肽段进行了定量分析,评估了过烷基化对蛋白质定量分析的影响。该研究结果表明,过量的烷基化修饰对蛋白质的定性与定量分析都可能产生较大影响。在蛋白质组学研究的样本处理流程中,应避免样本的过烷基化。     

基于共价色谱分离的含半胱氨酸肽段富集策略

多维色谱分离、串联质谱分析技术已在蛋白质组研究中得到广泛应用。然而生物样品的蛋白质以及全酶切肽段具有高度的复杂性,这严重干扰了蛋白质高通量、规模化的分析。通过标签肽段富集进行样品预分离可以降低体系的复杂程度。本文建立了一种基于共价色谱技术选择性分离富集含半胱氨酸肽的方法,从而降低了样品体系的复杂程度。首先以牛血清白蛋白(BSA)的酶切肽段为模型,对富集条件进行了优化和考察,并在此基础上通过5种蛋白质酶切肽段混合物的富集对该方法进行了验证。结果证明此方法的重现性好,富集效率高,富集特异性好,能有效地富集鉴定含半胱氨酸肽段。所建立的方法在复杂体系的蛋白质组研究中具有广泛的应用前景,为复杂样品的蛋白质高通量、自动化、规模化鉴定和定量研究提供了实用技术。     

IgG1型单克隆抗体对照品的一级结构解析

对单克隆抗体药物对照品(IgG1型)进行了全面的结构表征。采用Exactive plus EMR质谱测定了去N糖前后抗体的精确分子量,并通过计算N糖含量得出其完整分子量为148 285.0～149 020.8,完整去糖后分子量为145 810.4,N糖含量为1.67%～2.15%。优化了全柱成像实时等电聚焦毛细管电泳(WCID-cIEF)检测方法,结果显示该抗体等电点分布在8.21～8.74之间,其中主成分等电点为8.61,相对含量为61.43%。继而使用离子交换色谱检测了电荷异质性,发现碱性峰含量为4.1%,酸性峰含量为23.9%,主峰含量为72.0%,与WCID-cIEF结果吻合,并证明了方法间良好的重现性。通过切糖前后的肽图分析,获得糖肽分布信息,识别出糖修饰位点及重轻链的互补决定区(CDR),甲硫氨酸(M)的氧化位点及氧化率,并通过抗体还原前后的肽图解析出二硫键连接。研究结果同时提示该抗体对照品无C末端糖化修饰现象。     

螯合稀土金属标记蛋白质技术的建立与优化

建立了一种基于螯合稀土金属标记蛋白质的技术,优化了影响标记效率的各种条件.在50 mmol/L TEAB缓冲体系(pH 7.5),DTPA与肽段摩尔比为100: 1,常温反应30 min的条件下,DTPA标记完全;在100 mmol/L乙酸铵缓冲液(pH 6.0),稀土金属与DTPA摩尔比为4: 1,37 ℃反应1 h的条件下,稀土金属螯合反应完全.考察了不同稀土金属的螯合效率,发现离子半径最小的Lu螯合效率最高.本方法被成功应用于肽混合物标记.     

一种可用于评估肽质量指纹谱数据的方法——反转错位数据库

反转数据库常被用于估算大规模蛋白质组研究中串联质谱搜索数据库结果的可靠性。然而,对于经典的且现在依然在产出的肽质量指纹谱的数据,这种方法并不适用。为解决该问题,构建了另外一种随机数据库,称为反转错位数据库。这种数据库是在反转数据库的基础上,将序列中的K和R及其后的氨基酸交换位置(对于胰蛋白酶切割的结果)获得。这种处理避免了某些肽段因前后胰蛋白酶酶切位点氨基酸相同而在序列反转后质量依然不变,导致肽质量指纹谱法无法区分的问题。通过串联质谱和肽质量指纹谱测试数据的搜索结果,证明了这种方法同时适用于串联质谱和肽质量指纹谱的数据。这种方法扩大了经典反转数据库的适用范围,将对评估和整合串联质谱和肽质量指纹谱的数据具有重要意义。     

基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记

建立了一种基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记,定量蛋白质组学研究方法,优化了影响标记效率的各种条件.在pH 8.0的Na2B4O7/H3BO3 缓冲体系中,当乙酸酐摩尔浓度25倍过量于肽段摩尔量,22℃反应30 min时,标记即可完全.对多对H6/D6-乙酸酐标记肽段在基质辅助激光解吸电离质谱中的动态范围及定量准确度进行了考察,并通过串联质谱分析确定了乙酰化位点.结果表明: 在10倍和30倍动态范围内,线性关系良好(r=0.99, r=0.98),理论值和观测值的偏差分别为0.5%和20%.     

基于固相萃取的微量糖蛋白糖基化修饰表征技术的建立

结合自制亲水固相萃取富集柱和生物质谱鉴定技术,实现了糖基化蛋白质核糖核酸酶B的糖含量测定、糖基化位点确认、聚糖富集及结构表征,以及不同糖型相对丰度分析。结果表明:其糖含量8.47%,糖基化位点为34位的Asn,糖链主要为5种高甘露糖型结构(Man5-9GlcNAc2)。所建立的HILIC富集技术,有利于针对微量生物样本,如生物工程药物糖蛋白及重要功能糖蛋白,开展位点特异性糖链结构解析,为糖蛋白质的药效或功能研究提供线索。     

改进的~(18)O同位素标记法标记蛋白质多肽

针对18O同位素标记反应两个重要影响因素——肽段分散度和胰酶灭活方法,进行了标记条件的改进和灭活方法的优化。在H218O中加入RapigestTM SF助溶剂并微波辅助加热,使α-酪蛋白胰酶酶切肽段的标记效率得到明显改进(18O/16O峰面积比值>99%)。标记后,对胰酶进行还原烷基化化学修饰彻底灭活,使标记后的肽段稳定性显著提高,放置6d不发生回交反应。对标准蛋白质甲状腺球蛋白酶切肽段混合物标记后的质谱实验结果表明:优化的标记方法能快速稳定地标记蛋白质酶切多肽。     

微量样本中N-糖组分析技术的发展与应用

针对糖组学分析面临的初始样本量需求较高的技术挑战,该研究发展了一种微量样本N-糖链制备技术(GPAT),通过在移液枪头(Tip)中分别装填C_(18)和HILIC填料,实现了一站式原位蛋白消化、N-糖链释放和富集。与目前普遍采用的基于过滤辅助样品制备(FASP)技术的N-糖组分析策略相比,使用GPAT技术可以实现微量免疫球蛋白G(IgG)和人肝癌HepG2细胞提取蛋白的原位N-糖链的释放和富集,样本起始量减少90%,可以从10μg IgG和10μg的HepG2细胞蛋白中分别检测到20条和39条N-糖链。从6例健康人(3例男性,3例女性)尿液中提取的10μg尿蛋白中检测到49条N-糖链。该方法实现了微量复杂蛋白样本N-糖链简便、快速的定量分析策略,为进一步的糖组学方法推广应用奠定了基础。     

质谱智能选择反应监测用于蛋白质绝对定量中母子离子对确证的方法研究

质谱选择反应监测(SRM)技术在蛋白质绝对定量分析中的应用越来越广泛,其成功应用的关键是肽段母子离子对的正确选择与确证.触发采集二级图谱是目前常用的母子离子对确认方法,但分析效率有待于提高.质谱智能选择反应监测(iSRM)是新近发展的高通量分析方法.为了考察该方法用于通量化母子离子对确证时的效果,选用牛血清白蛋白(BSA)和酵母蛋白提取物作为样品进行分析.结果表明,该方法具有更高的分析灵敏度,可以对低至1 fmol BSA样品中的母子离子对进行确证,而且相对于触发采集二级图谱方法而言,具有更高的分析通量,为规模化母子离子对选择与确证提供了一种新的策略.