带有乙型肝炎表面抗原基因的重组痘苗病毒——一种可能的乙型肝炎活疫苗

我们组建了带有痘苗病毒胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因的痘苗病毒载体,并将乙型肝炎(以下简称乙肝)表面抗原(HBsAg)基因(adr亚型)插入载体质粒,置于痘苗病毒早期启动基因的调控下。通过感染与转染相结合的方法,得到了带有乙型肝炎表面抗原基因的重组痘苗病毒。它保持了原有的感染性,并能有效地表达乙肝表面抗原。当病毒接种量为每个细胞1PFU(空斑形成单位)时,每1×10~6细胞感染后24h可产生2—3μg HBsAg,其中大部分释放于细胞培养液中。每升培养液可以产生0.5—1mg HBsAg。表达产物HBsAg能形成颗粒,其大小、浮力密度,多肽组份等都与病人血清中的HBsAg颗粒相同。用重组痘苗病毒免疫家兔,可以产生抗乙肝表面抗原的专一性抗体。实验结果表明,利用本文组建的重组痘苗病毒不仅可以提供一个生产乙肝表面抗原的系统,而且这种重组痘苗病毒就可作为活疫苗使用,来预防乙肝病毒感染。     

以β-半乳糖苷酶为标记选出高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的天坛株重组痘苗病毒

我们从天坛株痘苗病毒的基因组中,分离编码11K及25K蛋白的双向转录启动子,以胸苦激酶(TK)基因为旁侧序列,插入到质粒pAT153中,构建成可以同时表达两个外源基因的载体质粒,并将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因及大肠杆菌的β-半乳糖苦酶(LacZ)基因,插入该载体质粒,使它们分别在11K及25K启动子钠控制下,构建成共表达质粒。用钙沉淀法将此质粒DNA同天坛株痘苗病毒在细胞内进行同源重组,在含X-gal的培养基挑蓝色蚀斑,简便、准确地选出重组痘苗病毒。所选到的重组痘苗病毒高效表达了HBsAg。我们还把上述重组痘苗病毒接种动物,观察了它们的毒力及免疫原性。     

带肝细胞受体结合区的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白性质的研究——形成表面抗原颗粒和在不同细胞中的分泌

我们用定向缺失突变和体外重组法构建了含有肝细胞受体结合区的乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原主蛋白(S蛋白)基因。该基因在猴肾细胞COS-M6中的表达产物(S309蛋白)能形成表面抗原(HBsAg)颗粒并分泌出细胞。它在细胞和培养液中稳定,并能分别被抗HBsAg和抗preSl区的抗血清所沉淀。CsCl密度梯度分析显示S309蛋白形成颗粒的密度比S蛋白略大(1.25g/ml)。S309蛋白在肝癌细胞株中容易分泌,分泌量和S蛋白相近。但它在COS-M6细胞中的分泌和肝细胞株相差悬殊,分泌量只有10％左右,而且在培养液中出现较迟。和S蛋白的同时表达则能明显地提高它的分泌效率。     

猪IL-18成熟蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性鉴定

以含猪IL-18全基因的重组质粒pGEM-IL-18为模板,PCR扩增猪IL-18成熟蛋白基因.将IL-18成熟蛋白片段定向插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-IL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白(His-IL-18),并进行融合蛋白的纯化、生物学活性鉴定.结果表明,SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为2.1×104的融合蛋白,westem blot证实His-IL-18能与猪IL-18单克隆抗体发生特异性反应.重组猪IL-18经纯化后,能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应,在Marc-145细胞上抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性为2.50×103IU/mg,在PK-15细胞上抗猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的活性分别为2.00×103和2.24×103IU/mg.表明建立的表达系统能够表达重组猪IL-18,表达的重组猪IL-18具有一定的生物学活性.     

汉坦病毒嵌合基因G2S0.7与CTL多表位重组腺病毒的构建及免疫学分析

目的:构建含有汉坦病毒M基因(编码糖蛋白G2)和部分S基因(编码核蛋白主要抗原区段)以及S基因的多个CTL表位的多种蕈组腺病毒表达载体,并对这些重组腺病毒的免疫学特性进行研究.方法:构建含目的基因的重组腺病毒载体,并在VeroE6细胞中进行表达,利用纯化后的重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、微量细胞中和试验、T淋巴细胞增殖实验及CTL杀伤实验等方法检测免疫反应.结果:成功表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别的融合蛋白;重组的腺病毒可以有效诱导针对汉坦病毒NP及GP的体液免疫应答和细胞免疫应答;同时我们发现含有CTL表位的重组腺病毒比不含CTL表位的重组腺病毒可以诱导小鼠产生更为有效的细胞免疫反应.结论:构建的含CTL多表位的重组腺病毒可以有效的提高嵌合基因刺激细胞免疫应答的能力.     

乙型肝炎病毒表面抗原互补脱氧核糖核酸的分子克隆及检定

用特异性免疫沉淀法从一人肝癌细胞株(PLC/PRF/5)中浓集乙型肝炎表面抗原(HBsAg)信使核糖核酸(mRNA),制得互补脱氧核糖核酸(cDNA),进行克隆.用已克隆化的病毒探针进行原位杂交,检得一个含HBsAg cDNA的菌株.对它进行了限制性内切酶谱及核苦酸序列分析.该 HBsAg cDNA经~(32)P标记后与PLC/PRF/5细胞DNA和RNA分别进行分子杂交的结果,显示出整合入该宿主基因组中乙型肝炎病毒的拷贝至少有6个;含HBsAg特异序列的PNA有三种、本文对乙型肝炎病毒在原发性肝癌致癌基因中可能的作用进行了讨论。     

表达烟草花叶病毒外壳蛋白的转基因烟草及其对TMV的抗性

利用体外重组DNA技术构建携带烟草花叶病毒(TMV,国内流行的普通株)外壳蛋白基因(CP)的中间表达载体,通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒,重组TMV-CP基因被转移至烟草细胞,并获得大量再生的转基因烟草。工程烟草的基因组经Southern印迹法分析证明,CP基因在再生工程株染色体中有1—5个拷贝的插入。分子杂交分析确证TMV-CP基因在转基因株中获得正确表达,其mRNA和蛋白产物的丰度分别达0.005—0.01％及0.05—0.2％。攻毒实验表明90％以上的能表达TMV—CP基因的工程烟草能不同程度地抑制病毒的复制、扩散,并显著延缓,减轻系统病状的发生。有3株工程植株直至花期无病状表现,生长正常。这一抗性作用机制在于转化细胞中的外壳蛋白在病毒侵染早期有效地抑制了入侵病毒颗粒的脱壳,从而阻断病毒的复制。     

人乙肝病毒表面抗原基因在转基因烟草中的表达

本文报道了将乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原基因导入植物中并得到了表达。将人乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原(HBs Ag)基因插入植物双元载体pRoK Ⅱ的CaMV 35S启动子下游,构建重组质粒pRoK Ⅱ-HBs ag,将此质粒导入农杆菌LBA4404中,利用农杆菌感染叶盘的方法转化烟G-140品种,得到了抗卡那霉素的转化植株,并进一步获得了后代植株。酶联免疫分析表明转化植株及其后代均能产生具免疫活性的HBs Ag;免疫吸附电镜观察表明,转化植株产生的HBS Ag呈典型的直径为22 nm的颗粒。本文显示了用植物廉价生产HBs Ag的可能性。     

在重组痘苗病毒中共表达HIV-1p24gag与hIL-6基因

以ＨＩＶ－１ ｐ２４ｇａｇ 与ｈＩＬ－６ 基因在重组痘苗病毒中的共表达研究为目的,将痘苗病毒复制非必需区血凝素（ＨＡ） 基因作为侧翼,把编码人白细胞介素６（ｈＩＬ－６）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐ１６ＱＦ１ －２４ 的下游,构建成含有ＨＩＶ－ １ｐ２４ｇａｇ 和ｈＩＬ－６ 两种外源基因的重组表达质粒ｐ１６ＱＦ２４ －ＩＬ６ ,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选,获得了重组痘苗病毒ｖ１６ＱＦ２４ －ＩＬ６．经间接免疫荧光试验、Ｄｏｔ－ ＥＬＩＳＡ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ 等检测证明,重组病毒能同时表达ｐ２４ｇａｇ 蛋白和ＩＬ－６ 蛋白,表达产物的相对分子质量分别为２－４×１０４ ,２－６×１０４ ．此种方式表达的外源蛋白持续释放,可产生更强的免疫效果,可望用于ＨＩＶ疫苗的研究．     

重组HEV衣壳蛋白截短体的表达及鉴定

戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)感染引起的肠道病毒性传染病. HEV是一种无囊膜的单股正链RNA病毒, 其编码区由3个开放阅读框(ORF)组成, 属戊型肝炎病毒科. HEV衣壳蛋白由ORF2编码. 本研究根据编码HEV ORF2 aa382~aa674的核苷酸序列克隆了p293基因, 并将其克隆入原核表达载体pET28a, 利用大肠杆菌BL21(DE3)对HEV衣壳蛋白截短体(p293)进行了表达. SDS-PAGE和Western blot检测结果表明, 在优化的表达条件下(1 mmol/L IPTG, 250 r/min, 37℃, 5 h), 重组蛋白p293能够在大肠杆菌内有效表达, 目的蛋白约占总蛋白的66.15%. TEM检测结果显示, 原核表达的p293能够在体外形成约30~40 nm的病毒样颗粒. 免疫印迹和免疫荧光检测结果表明, p293与HEV标准阳性血清具有良好的反应原性和反应特异性. 实验结果表明, p293可应用于HEV宿主吸附和病毒装配研究, 为HEV的预防与诊断研究奠定了基础.     

SARS病毒核衣壳蛋白的表达与鉴定

依据Genebank中SARS基因组序列和酵母菌对密码子的选择性,采用人工合成的方法,合成了优化的SARS病毒核衣壳蛋白(N)的全基因(1296bp),与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建成重组表达载体pPIC9K-N.重组载体转化毕赤酵母GS115,并经MD平板和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115-pPIC9K-N.用甲醇诱导其分泌表达目的蛋白并对表达产物进行分析、浓缩与鉴定.结果表明,SARS病毒核衣壳蛋白能实现在毕赤酵母中高效表达,表达量达到20%,初步纯化后的产物具有良好的抗原特异性.     

表达K_(99)和F_(41)双价保护性抗原工程菌株的构建及免疫效果研究

本文应用基因重组技术,将引起犊牛、羔羊大肠菌腹泻的主要致病因子的保护性抗原基因K_(99)和F_(41)从野生株先分别克隆,然后组构成同时表达两种抗原的工程菌疫苗候选株。研究了该工程菌表达的两种抗原的性质,影响表达的条件。同时经过免疫怀孕母羊然后进行人工攻毒及田间大面积免疫羊群,证明该工程疫苗候选株能有效诱发机体的免疫应答,对羔羊有显著地保护作用。     

人尿激酶原在CHO细胞中的基因扩增与高效表达

本文通过基因共转染和基因共扩增方法,在SV40病毒晚期启动子控制下成功地在中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-DHFR~-)中高效表达了人尿激酶原,其表达水平在5×10~(-6) mol/L氨甲喋呤存在下可达2—3μg/10~6细胞/24 h。采用PMA诱导可将表达水平提高至3.5—4μg/10~6细胞/24 h。相应的Pro-UKcDNA在细胞基因组上整合的拷贝数为200—300拷贝/细胞。Western blot分析表明,表达出来的重组Pro-UK与天然Pro-UK具有相似的分子量:S_(2444)测活法证明重组Pro-UK具有体外酰胺水解活性。     

热敏相分离荧光免疫分析乙肝表面抗原的新方法

以N-异丙基丙烯酰胺为单体,将水溶性热敏高分子聚异丙基丙烯酰胺(PNIP)和抗体偶联,用异硫氰酸荧光素标记羊抗人乙肝表面抗原抗体,建立了夹心型热敏相分离荧光免疫分析乙肝表面抗原(HBsAg)的新方法.评价了抗体在PNIP上的固定效率和非特异性吸附情况.HBsAg在0.5～100μg/mL范围内与体系荧光强度呈良好的线性关系,检出限为10ng/mLHBsAg.该方法既具有均相免疫分析的快速性,又有固相免疫分析的高灵敏度.用于乙肝病人血清中HBsAg水平的测定,结果令人满意.     

带有EGF受体干扰序列的γ干扰素新分子抗肿瘤细胞增殖活性的提高

利用基因工程技术,将天然IFN-γ分子的N端132个氨基酸与带有上皮生长因子(EGF)样多肽C端保守序列融合,构建了干扰素重组体IFN-γ132PGIX_(16).其中X_(16)由EGF样多肽C端16个氨基酸组成,PGI为连接肽序列。将此重组体基因插入表达载体pBV220P_RP_L串连启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,在cIts857基因的调节下,通过升温诱导表达.表达产物与其母体天然IFN-γ相比,不仅保持了较高的抗病毒活性,抗病毒滴度达530MU/L菌液,而且明显地提高了抗肿瘤细胞增殖活性.在EGF存在的条件下,干扰素重组体的抗鼻咽癌细胞CNE-2增殖活性明显高于其母体分子(p<0.01).提示重组体分子IFN-γ132PGIX_(16)同时具有EGF受体干扰活性.     

人IL-16基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定人白细胞介素16(IL-16)的重组腺病毒pAd-IL-16表达载体,为进一步研究IL-16功能奠定基础.方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),组胺刺激后提取总RNA,RT-PCR扩增IL-16基因,将其克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAd-IL-16,转染 HEK 293T细胞包装病毒.荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,RT-PCR和Western blot分别分析细胞内IL-16 mRNA和蛋白质的表达.结果:经双酶切及基因鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见约400 by插人片段,测序结果和GenBank中的基因序列一致;重组病毒效价为2.8×10～8 pfu/mL;重组病毒感染后,HEK 293T细胞中IL-16mRNA和蛋白质均有表达.结论:成功构建IL-16重组腺病毒载体,并可在HEK 293T细胞中表达,为进一步研究IL-16的功能奠定了基础.     

合并血浆中病毒标记检测临界值的确定分析

确保合并血浆检测结果的判定准确可靠,能够有效保证合并血浆的病毒安全性,对合并血浆乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体检测时不同厂家检测试剂的临界值进行确定。(1)使用双抗体夹心酶联免疫法对合并血浆HBsAg和HIV-1/HIV-2抗体的检测临界值进行确定。(2)使用酶联免疫法检测合并血浆HCV抗体的临界值进行确定。经检测和计算,两个厂家检测试剂的检测临界值系数分别为乙型肝炎病毒表面抗原23.398%和26.845%、丙型肝炎病毒抗体9.012%和16.481%、人类免疫缺陷病毒抗体20.025%和23.424%。     

溶栓与抗栓双功能尿激酶原突变体的模拟、构建与表达

将抗栓肽(Decorsin)嫁接到低分子量尿激酶原(scuPA-32k)上,可以期望获得既具有抗血小板聚集活性,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子.利用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构,证明其活性区可以正常发挥功能.根据大肠杆菌偏好密码子合成Decorsin的基因,与scuPA-32k基因融合在一起,构建新的嵌合体基因dscuPA,并在大肠杆菌中通过IPTG进行诱导表达,该重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式存在.对包涵体进行变性和复性并通过层析纯化得到目的蛋白质.用纤维蛋白平板法测得重组蛋白的比活为92000IU/mg.激活纤溶酶原的酶促动力学性质与天然低分子量尿激酶相似,且有较强的抑制血小板聚集的功能.重组蛋白dscuPA不但具有较强的溶栓功能,而且具有抗栓功能.     

口蹄疫病毒3ABC基因截短体在毕赤酵母中的表达及鉴定

将长为525 bp的口蹄疫病毒3ABC基因截短体克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中, 构建了重组表达质粒pPIC9K-3ABCt. 用BglⅡ线性化后, 电转化毕赤酵母菌GS115, 经表型筛选, PCR鉴定, 获得阳性重组菌(GS115/pPIC9K-3ABCt). 然后进行诱导表达, 通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物. 结果表明, 重组菌株成功分泌表达了分子量为40000, 具有免疫反应活性, 且呈二聚体形式的目的蛋白. 在96 h时表达量达到最高峰, 占分泌总蛋白的18%, 达到23.4 mg/L. 为进一步研制口蹄疫免疫和感染动物鉴别诊断试剂奠定了基础.     

小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

目的:制备B7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用.方法:首先采用PCR技术分别从pMD19-T/小鼠B7-H3和pMD19-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因.通过重叠PER技术将2段基因连接成B7-H3-Fc,经EcoR I和Bgl Ⅱ双酶切后插入真核表达载体plRES2-EGFP构建成pIRES2-EG-FWB7-H3-Fc重组载体.脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选能稳定分泌表达小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞,并经Western blot鉴定.该转基因细胞无血清培养后,收集细胞上清、超滤浓缩后行经Protein G柱纯化,获得纯品B7-H3-Fc融合蛋白.通过CCK-8以及ELISA方法检测小鼠B7-H3-Fc融合蛋白对T细胞体外增殖及细胞因子分泌的影响.结果:成功地构建了能稳定表达B7-H3-Fc融合蛋白基因的CHO转基因细胞株,该融合蛋白能够剂量依赖性地促进T细胞体外增殖及IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌.结论:本研究提示B7-H3作为重要的共刺激分子,在调节T细胞免疫应答中发挥了正性共刺激作用.