促进动物生长的新型基因工程疫苗研究

将动物生长抑素(ss)基因融合到乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因3′末端,构建融合基因重组痘苗病毒。重组病毒(vv-HBs/ss)能表达HBsAg杂合颗粒,并将ss抗原决定簇暴露在颗粒表面。以vv-HBs/ss作为活载体苗免疫家兔,能刺激产生ss抗体;免疫大鼠,能促进生长。     

以β-半乳糖苷酶为标记选出高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的天坛株重组痘苗病毒

我们从天坛株痘苗病毒的基因组中,分离编码11K及25K蛋白的双向转录启动子,以胸苦激酶(TK)基因为旁侧序列,插入到质粒pAT153中,构建成可以同时表达两个外源基因的载体质粒,并将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因及大肠杆菌的β-半乳糖苦酶(LacZ)基因,插入该载体质粒,使它们分别在11K及25K启动子钠控制下,构建成共表达质粒。用钙沉淀法将此质粒DNA同天坛株痘苗病毒在细胞内进行同源重组,在含X-gal的培养基挑蓝色蚀斑,简便、准确地选出重组痘苗病毒。所选到的重组痘苗病毒高效表达了HBsAg。我们还把上述重组痘苗病毒接种动物,观察了它们的毒力及免疫原性。     

乙型肝炎病毒表面抗原preS基因在痘苗病毒系统中的分泌型表达

本文对带preS2的乙肝病毒表面抗原基因以及带preS1和preS2的乙肝表面抗原全基因的重组痘苗病毒vTMS-1和vTLS-1的表达和分泌进行了研究。在人TK-143细胞中它们能表达各自所编码的蛋白——乙肝表面抗原中分子蛋白和大分子蛋白。产物是可分泌的,并能形成22nm颗粒。分泌在培液中的表达产物能分别与抗preS2和抗preS1的单抗反应,并保持了天然表面抗原大分子和中分子蛋白所具有的多聚人血清白蛋白的受体活力。它们的表达产物中都还合有乙肝表面抗原主蛋白的成分。     

带肝细胞受体结合区的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白性质的研究——形成表面抗原颗粒和在不同细胞中的分泌

我们用定向缺失突变和体外重组法构建了含有肝细胞受体结合区的乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原主蛋白(S蛋白)基因。该基因在猴肾细胞COS-M6中的表达产物(S309蛋白)能形成表面抗原(HBsAg)颗粒并分泌出细胞。它在细胞和培养液中稳定,并能分别被抗HBsAg和抗preSl区的抗血清所沉淀。CsCl密度梯度分析显示S309蛋白形成颗粒的密度比S蛋白略大(1.25g/ml)。S309蛋白在肝癌细胞株中容易分泌,分泌量和S蛋白相近。但它在COS-M6细胞中的分泌和肝细胞株相差悬殊,分泌量只有10％左右,而且在培养液中出现较迟。和S蛋白的同时表达则能明显地提高它的分泌效率。     

乙型肝炎病毒核心抗原基因结构对其在大肠杆菌中表达的影响

本文将含乙型肝炎(以下简称乙肝)病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)基因的1kbHhaI酶切HBV·DNA片段用BAL-31外切酶切除两端非编码区,连接EcoRI合成接头后插入到载体pUR222的EcoRI位点,转化受体菌后筛到一系列不同HBcAg表达水平的重组体。分析高表达和低表达重组体工作中,发现在同一乳糖启动子、核糖体结合部位(SD序列)和Lac Z基因N端第5氨基酸后连接的HBcAg基因,由于在ATG5′端上游—7至—35核苷酸区有一呈部分迥文的序列,当转录成mRNA时可形成一环茎二级结构,是否用BAL—31酶切除此结构对表达水平影响极大。高表达重组体HBcAg产量可占菌体总蛋白9％,低表达的只为其千分之一。本文并对此现象在原核细胞中表达真核基因的意义进行了讨论。     

表达烟草花叶病毒外壳蛋白的转基因烟草及其对TMV的抗性

利用体外重组DNA技术构建携带烟草花叶病毒(TMV,国内流行的普通株)外壳蛋白基因(CP)的中间表达载体,通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒,重组TMV-CP基因被转移至烟草细胞,并获得大量再生的转基因烟草。工程烟草的基因组经Southern印迹法分析证明,CP基因在再生工程株染色体中有1—5个拷贝的插入。分子杂交分析确证TMV-CP基因在转基因株中获得正确表达,其mRNA和蛋白产物的丰度分别达0.005—0.01％及0.05—0.2％。攻毒实验表明90％以上的能表达TMV—CP基因的工程烟草能不同程度地抑制病毒的复制、扩散,并显著延缓,减轻系统病状的发生。有3株工程植株直至花期无病状表现,生长正常。这一抗性作用机制在于转化细胞中的外壳蛋白在病毒侵染早期有效地抑制了入侵病毒颗粒的脱壳,从而阻断病毒的复制。     

乙型肝炎病毒表面抗原互补脱氧核糖核酸的分子克隆及检定

用特异性免疫沉淀法从一人肝癌细胞株(PLC/PRF/5)中浓集乙型肝炎表面抗原(HBsAg)信使核糖核酸(mRNA),制得互补脱氧核糖核酸(cDNA),进行克隆.用已克隆化的病毒探针进行原位杂交,检得一个含HBsAg cDNA的菌株.对它进行了限制性内切酶谱及核苦酸序列分析.该 HBsAg cDNA经~(32)P标记后与PLC/PRF/5细胞DNA和RNA分别进行分子杂交的结果,显示出整合入该宿主基因组中乙型肝炎病毒的拷贝至少有6个;含HBsAg特异序列的PNA有三种、本文对乙型肝炎病毒在原发性肝癌致癌基因中可能的作用进行了讨论。     

汉坦病毒嵌合基因G2S0.7与CTL多表位重组腺病毒的构建及免疫学分析

目的:构建含有汉坦病毒M基因(编码糖蛋白G2)和部分S基因(编码核蛋白主要抗原区段)以及S基因的多个CTL表位的多种蕈组腺病毒表达载体,并对这些重组腺病毒的免疫学特性进行研究.方法:构建含目的基因的重组腺病毒载体,并在VeroE6细胞中进行表达,利用纯化后的重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、微量细胞中和试验、T淋巴细胞增殖实验及CTL杀伤实验等方法检测免疫反应.结果:成功表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别的融合蛋白;重组的腺病毒可以有效诱导针对汉坦病毒NP及GP的体液免疫应答和细胞免疫应答;同时我们发现含有CTL表位的重组腺病毒比不含CTL表位的重组腺病毒可以诱导小鼠产生更为有效的细胞免疫反应.结论:构建的含CTL多表位的重组腺病毒可以有效的提高嵌合基因刺激细胞免疫应答的能力.     

人乙肝病毒表面抗原基因在转基因烟草中的表达

本文报道了将乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原基因导入植物中并得到了表达。将人乙型肝炎病毒(adw亚型)表面抗原(HBs Ag)基因插入植物双元载体pRoK Ⅱ的CaMV 35S启动子下游,构建重组质粒pRoK Ⅱ-HBs ag,将此质粒导入农杆菌LBA4404中,利用农杆菌感染叶盘的方法转化烟G-140品种,得到了抗卡那霉素的转化植株,并进一步获得了后代植株。酶联免疫分析表明转化植株及其后代均能产生具免疫活性的HBs Ag;免疫吸附电镜观察表明,转化植株产生的HBS Ag呈典型的直径为22 nm的颗粒。本文显示了用植物廉价生产HBs Ag的可能性。     

在重组痘苗病毒中共表达HIV-1p24gag与hIL-6基因

以ＨＩＶ－１ ｐ２４ｇａｇ 与ｈＩＬ－６ 基因在重组痘苗病毒中的共表达研究为目的,将痘苗病毒复制非必需区血凝素（ＨＡ） 基因作为侧翼,把编码人白细胞介素６（ｈＩＬ－６）的基因片段克隆到真核表达质粒ｐ１６ＱＦ１ －２４ 的下游,构建成含有ＨＩＶ－ １ｐ２４ｇａｇ 和ｈＩＬ－６ 两种外源基因的重组表达质粒ｐ１６ＱＦ２４ －ＩＬ６ ,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选,获得了重组痘苗病毒ｖ１６ＱＦ２４ －ＩＬ６．经间接免疫荧光试验、Ｄｏｔ－ ＥＬＩＳＡ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｏｌｔ 等检测证明,重组病毒能同时表达ｐ２４ｇａｇ 蛋白和ＩＬ－６ 蛋白,表达产物的相对分子质量分别为２－４×１０４ ,２－６×１０４ ．此种方式表达的外源蛋白持续释放,可产生更强的免疫效果,可望用于ＨＩＶ疫苗的研究．     

在GAL-10启动子控制下HBsAg基因在酵母中表达

本文运用既能在E。Coli又能在酵母Saccharomyces cerevisiae中复制的杂合质粒YEP51,与乙型肝炎病毒(adr亚型)表面抗原基因进行重组。重组质粒pGHBs-1在酵母中使表面抗原基因在GaL-10启动子控制下得到表达,表达产物聚合成颗粒状,其大小和形状与病人血清中的表面抗原蛋白相似,100ml培养物约能产生1μg表面抗原蛋白。     

C-myc反义RNA特异性诱发人食管癌细胞程序性死亡

本文报道以含有neo基因序列的逆转录病毒为载体,按1:1感染强度(细胞:病毒颗粒)向人食管癌细胞系EC8712中导入可持续产生互补于c-myc基因第二外显子及其两侧序列共1.53kb片段的反义RNA基因,得到G418抗性细胞。后者表型发生明显的改变,细胞生长抑制率为86.3％,c-Myc蛋白含量降低80％左右,而胎儿和成人食管上皮原代培养细胞的形态和生长速度没有明显改变。在1:10感染强度下,不经G418筛选,感染后12h行Southern blot(DNA)和Northern blot(RNA)分析,分别发现外源反义c-myc基因完整地整合到癌细胞基因组中并能有效表达,同时使内源性c-myc基因的表达降低了73.6％。病毒感染的瘤细胞在裸鼠体内形成肿瘤的能力明显下降。首次发现,反义c-myc RNA可抑制c-myc高表达的人食管癌细胞生长、诱导分化和程序性细胞死亡,同时,不损害或很少影响myc表达低的正常细胞。     

人IL-16基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定人白细胞介素16(IL-16)的重组腺病毒pAd-IL-16表达载体,为进一步研究IL-16功能奠定基础.方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),组胺刺激后提取总RNA,RT-PCR扩增IL-16基因,将其克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAd-IL-16,转染 HEK 293T细胞包装病毒.荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,RT-PCR和Western blot分别分析细胞内IL-16 mRNA和蛋白质的表达.结果:经双酶切及基因鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见约400 by插人片段,测序结果和GenBank中的基因序列一致;重组病毒效价为2.8×10～8 pfu/mL;重组病毒感染后,HEK 293T细胞中IL-16mRNA和蛋白质均有表达.结论:成功构建IL-16重组腺病毒载体,并可在HEK 293T细胞中表达,为进一步研究IL-16的功能奠定了基础.     

带有人凝血因子Ⅸ cDNA的反转录病毒载体的构建及其在离体细胞中的高效表达

报道了带有人凝血因子IX cDNA的高滴度高表达安全性反转录病毒载体的构建。采用LNL6反转录病毒载体为骨架,构建了由人巨细胞病毒启动子(hCMV)驱动的反转录病毒载体LNCIX,由反转录病毒LTR启动子驱动的反转录病毒载体LIXSN,以及由LTR和CMV启动子共同控制转录的反转录病毒载体LCIXSN,分别用电穿孔方法转导PA317辅助细胞株。LNCIX和LIXSN反转录病毒载体能在离体细胞中表达人IX因子蛋白,而LC'IXSN反转录病毒载体转移到离体细胞中没有检测到人IX因子蛋白。PA317/INCIX细胞的产病毒滴度为8×10~5CFU/ml,该重组病毒感染人纤维肉瘤细胞HT1080及血友病B患者皮肤成纤维细胞(HSF),用ELISA方法分别测定这些细胞的IX因子蛋白产量,LNCIX载体在HT-1080细胞中的人IX因子平均表达量为3.3μg/10~6细胞·d~(-1);在HSF细胞中的平均表达量为2.5μg/10~6细胞·d~(-1),其中80％以上的IX因子具有凝血活性,与过去相比,提高了产病毒滴度,增加了人IX因子的平均表达量,病毒载体骨架的设计更完善,降低了产生野生型病毒的概率,提高了安全性,对于进一步开展血友病B的基因治疗具有重要的意义。     

快速诊断乙型肝炎表面抗原免疫胶乳

自七十年代以来,国内外用高分子免疫胶乳作为临床诊断疾病的新试剂得到广泛应用。但胶乳试剂用于乙肝表面抗原(HBsAg)的检测国内却未见报道。国外虽有专利,但仍处于完善阶段。我所与四川医学院协作研制成功了HBsAg诊断胶乳并经712例临床试验获得较满意结果。     

adr亚型乙型肝炎病毒表面抗原基因在大肠杆菌中的表达

利用adr亚型乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆株,组建表面抗原(HBsAg)基因表达质粒。用竞争性抑制放射免疫分析方法和聚丙烯酰胺——SDS凝胶电泳检测表达产物,获得了含HBsAg的杂合多肽。     

adr亚型乙型肝炎病毒表面抗原基因的核苷酸顺序

本文应用化学降解法测定了adr亚型乙型肝炎病毒pADR-1 DNA中包含表面抗原基因(s基因)的XhaI BamHI片段顺序,共1279碱基对。比较了adr亚型与已知的adw,adyw,ayw的s基因的核苷酸顺序及其编码的HBsAg氨基酸顺序的差异,发现了一些新的变异位点,差异集中分布在HBsAg的亲水区域。但在一些可能具有生物功能的位点,各亚型间并无变异,在遗传和进化中是相对保守的。比较s基因区和非s基因区的核苷酸变异情况表明,非s基因区的变异频率高一倍,s基因区是相对保守的。     

电击法磁性纳米颗粒作为水稻转基因载体的研究

建立了以磁性纳米颗粒为载体,由电击法介导基因导入植物细胞的优化方法。制备了粒径小于10nm的磁性纳米颗粒,与绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因融合制备基因载体,同时,制备水稻悬浮细胞,加入电极杯中,调节电击条件为:电压分别是800,1000和1200V,电容25μF,电阻200Ω,直径10mm,电击数次。利用倒置荧光显微镜观察转化后的悬浮细胞,可以明显看到绿色荧光蛋白在水稻细胞内表达。说明纳米颗粒基因载体在电击作用下能有效进入细胞,利用磁性纳米颗粒作为基因载体电击法转化植物细胞初步成功。     

带有人Ⅸ因子cDNA的反转录病毒载体的构建及其在血友病B患者皮肤成纤维细胞中的高效转移和表达

本文报道对血友病B实施基因治疗的可能性,首先将由SV40早期启动子,小鼠MT-1启动子和反转录病毒LTR启动子控制的Ⅸ因子cDNA构建到反转录病毒载体,然后用电穿孔法将构建的4个反转录病毒载体分别转入一株Amphotropic辅助细胞,PA317细胞,再用一株人纤维肉瘤细胞,HT1080细胞,测定这些辅助细胞的产病毒滴度,可得到2×10~4CFU/ml到5×10~5CFU/ml左右的病毒感染颗粒,用ELISA分别测定转有不同病毒载体的PA317细胞的Ⅸ因子蛋白产量,发现LTR启动子的表达效率最高,Ⅸ因子蛋白的分泌速率可达584ng/10~6细胞/24h,而SV40早期启动子和MT-1启动子的表达效率分别只有它的1/10和1/20,将表达效率最高的反转录病毒载体pXL—Ⅸ 1转入一株取自血友病B患者原代培养的皮肤成纤维细胞后同样能产生较高浓度的Ⅸ因子蛋白,其分泌速率可达549ng/10~6细胞/24h,其中75％以上的Ⅸ因子具有凝血活性,从而达到了首先在体外培养细胞纠正Ⅸ因子基因缺陷的目的,实现了血友病B基因治疗的第一步。     

地衣杆菌α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达

利用酵母MF-α1因子的启动子和信号序列构建载体并将缺失了启动子和信号序列的地衣杆菌α-淀粉酶基因重组进该载体上信号序列的下游,组建含α-淀粉酶基因的表达载体,经校正读码框架后实现α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达和产物的分泌;比较了酵母分泌的酶与在枯草杆菌中表达产生的酶的某些性质;讨论了基因表达和分泌的机制。