重组嗜热β-葡萄糖苷酶转化稀有人参皂苷Rd和CK

利用高效液相色谱(HPLC)法, 对重组嗜热β-葡萄糖苷酶(Fpglu1)转化稀有人参皂苷(Rd和CK)进行研究, 并表征了其催化动力学参数. 利用同源模建和分子动力学模拟等生物信息学技术, 探究了Fpglu1转化人参皂苷的结构基础及其相互作用. 结果表明, Fpglu1能够水解人参总皂苷生成稀有皂苷Rd和CK, 其催化人参皂苷Rb₁, Rb₂和Rc的K_m值分别为0.318, 1.840和5.269 mmol/L; 酶的转换数(k_cat)值分别为144.191, 0.572和0.011 s^-1. 当转化时间分别为6和102 h时, Rd和CK的产率达到最大, 分别为60%和93%. 通过对该酶的结构预测及皂苷分子的对接研究发现, 底物位于由疏水性氨基酸构成的底物口袋中, 氨基酸残基Glu194和Glu367是参与催化作用的关键, 且实验测得的酶促反应动力学参数(K_m)与对接的相互作用能量值存在线性关系.     

重组内切纤维素酶Fpendo5A转化三七总皂苷

从嗜热细菌基因组中克隆到1个新的纤维素酶基因,并在大肠杆菌中进行了高效可溶性表达,粗酶液经镍柱亲和层析进行分离纯化.利用快速分离液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪(RRLC/Q-TOF-MS)对重组内切纤维素酶Fpendo5A转化三七总皂苷的产物结构进行了鉴定,并进一步阐明其转化机制.结果表明,该酶的最适反应温度和pH值分别为80℃和5.5.Fpendo5A能够催化三七总皂苷中的主要皂苷成分,即Ra_1,Rb_1,Rc,Rd和Rg_3的侧链糖基的水解反应,但对于不同的皂苷底物,Fpendo5A选择性催化的侧链糖基类型不同.经鉴定,Fpendo5A转化Ra_1,Rb_1,Rc,Rd和Rg_3的转化产物分别为Rb_2,GypⅩⅦ,CMC_1,F_2和Rh_2.由此可见,Fpendo5A通过水解Rb_1,Rc,Rd和Rg3的C3位的β-(1,2)糖苷键分别生成GypⅩⅦ,CMC1,F2和Rh2.在转化Ra_1时,Fpendo5A通过水解Ra_1的C20位的α-(1,4)木糖苷键生成Rb2.     

稀有原人参二醇型皂苷的人肠道菌群生物转化

利用高分离度液相色谱-四极杆飞行时间质谱(RRLC-Q-TOF MS)和超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QQQ MS)定性定量分析了稀有原人参二醇型皂苷Rd, F₂, Rg₃, CK和Rh₂在离体人肠道菌群中的生物转化过程. 并将上述二醇型皂苷与人肠道菌群在体外厌氧, 37 ℃下共温孵育, 采用电喷雾质谱在负离子模式进行检测, 鉴定代谢产物, 监测其含量变化, 拟合代谢路径. 结果表明, 人参皂苷Rd主要被代谢为F₂, Rg₃, CK, Rh₂和PPD; 人参皂苷F₂主要被代谢为CK和PPD; 人参皂苷Rg₃主要被代谢为Rh₂和PPD; 人参皂苷CK和Rh₂主要被代谢为PPD. 在离体条件下, 人参皂苷Rd, F₂和Rg₃会被肠道菌群完全转化为其代谢产物, 而人参皂苷CK和Rh₂则不能被肠道菌群完全转化为其代谢产物. 原人参二醇型皂苷在人肠道菌群中的主要转化为脱糖基反应, 单糖苷和苷元是稀有原人参二醇型皂苷在人体内发挥药效的物质基础.     

人参皂苷β-葡萄糖苷酶基因的毕赤酵母载体构建及生物转化

将人参皂苷β-葡萄糖苷酶(Glu GF)基因与表达载体p PIC9K连接,构建重组质粒,转化至毕赤酵母中表达,并用于人参皂苷Rb1的催化转化.研究结果表明,成功构建了重组表达质粒p PIC9K-GluGF,转化后筛选到阳性重组毕赤酵母菌.重组菌产酶的最佳甲醇诱导体积为0. 5%,诱导时间为168 h.重组菌诱导培养制备的粗酶液具有Glu GF的活性,可以水解人参皂苷Rb1,产物中皂苷C-K含量达到0. 09 mg/mL,粗酶液中Glu GF的比活力为0. 67 U/mg.     

重组β-木糖苷酶转化人参皂苷Rb3及C-Mx

从Aspergillus niger NG1306菌株中扩增得到β-木糖苷酶基因anxyl, 与pPICZαA连接构建了表达载体pPICZαA-anxyl, 进一步在毕赤酵母KM71H中诱导表达获得了目的酶蛋白重组β-木糖苷酶(Anxyl); 并将其用于人参皂苷Rb₃及C-Mx的生物转化及催化动力学参数表征. 研究结果表明, Anxyl可将人参皂苷Rb₃和C-Mx分别转化为人参皂苷Rd和C-K. 酶学性质研究表明, 该酶最适反应pH=2.5, 最适反应温度为35 ℃; 在pH=2.0~5.0, 20和30 ℃条件下其具有较好的稳定性, Mg²⁺对酶活具有促进作用. Anxyl对葡萄糖和乙醇有较好的耐受性, 其催化对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)、 人参皂苷Rb₃和C-Mx水解的米氏常数(K_m)值分别为3.1, 1.55和1.04 mmol/L, 酶的最大反应速率(V_max)分别为1.9×10², 0.8×10³和8×10³ mmol/min, 酶的转换数(K_cat)值分别为5.55, 0.17和1.85 s^-1, 表明该酶对天然底物Rb₃和C-Mx具有更高的亲和力.     

液相色谱-质谱联用技术结合多探针底物法研究人参皂苷Rb1的体外代谢

以奥美拉唑、 苯妥英、 卡马西平和非那西丁为检测肝药酶细胞色素P450酶(CYP450)亚型的专属探针药物, 通过原型药物减少量测定法考察药物体外代谢的变化, 评价人参皂苷Rb1对CYP450不同亚型酶的作用. 结果表明, P2C9, P2C19和P3A4实验组与对照组差异不显著, P1A2实验组与对照组差异显著, 表明人参皂苷Rb1能诱导P1A2亚型酶的活性, 促进底物与酶反应, 加快底物的代谢, 而对P2C9, P2C19和P3A4三个亚型酶有弱的诱导或无诱导作用. 根据快速分离液相色谱-质谱联用(RRLC-MS/MS)检测结果推断, 人参皂苷Rb1在CYP450酶中的代谢产物可转化为人参皂苷Rb1氧化产物(Rb1+O)及人参皂苷Rd和F2.     

RRLC-Q-TOF-MS研究人参二醇型皂苷Rb_1,Rb_2和Rc的化学转化

将高分离快速液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(RRLC-Q-TOF-MS)联用技术用于人参二醇型(PPD)皂苷Rb_1,Rb_2和Rc在酸性条件下的化学转化研究,并对人参炮制过程中人参二醇型皂苷Rb_1,Rb_2和Rc及其转化产物的相对含量进行了分析.利用RRLC-Q-TOF-MS联用和串联质谱(MS/MS)技术对化合物的保留时间、精确分子量及串联质谱碎片信息进行分析,以鉴定化合物的结构.研究结果表明,人参二醇型皂苷在酸性条件下的化学转化包括:取代糖基的水解反应、Δ20(21)或Δ20(22)位的脱水反应和C24,C25位的水合加成反应.在MS/MS分析中,质谱峰m/z 459,477和441分别为人参二醇苷元、C24,C25位水合人参二醇苷元和Δ20(21)或Δ20(22)位脱水人参二醇型苷元的特征离子,这为人参二醇型皂苷及其转化产物的结构鉴定提供了依据,并以此总结了人参二醇型皂苷的化学转化途径.还利用所建立的方法研究了生晒参和红参(100和120℃)中PPD人参皂苷在炮制过程中的变化.     

密闭式微波降解法促进常见人参皂苷向稀有人参皂苷转化的规律

采用密闭微波技术对7种常见人参皂苷单体(Rb1,Rb2,Rb3,Rc,Rd,Re和Rg1)进行降解,通过高效液相色谱(HPLC)分析并与相同条件下非微波降解物对比,研究了密闭微波降解人参皂苷的产物在化学结构及组成上的变化规律,以期快速、高效地制备生物活性高的稀有人参皂苷.结果表明,密闭式微波降解法能够使常见人参皂苷基本降解完全,而相同条件下非微波降解法则基本不发生降解.原人参二醇型人参皂苷易水解掉C20位糖,并发生C20位构型变化,生成20(R)-Rg3和20(S)-Rg3,其中20-(R)为优势构型,C20位羟基进一步脱水产生稀有人参皂苷Rk1和Rg5.同时,20(S/R)-Rg3失去C3位的1分子葡萄糖转化为20(S/R)-Rh2,C20位羟基再进一步脱水生成了Rk2和Rh3.此外,人参皂苷C20位所连的糖种类与构型影响了降解产物中各稀有皂苷的组成与比例,但7种原人参二醇型人参皂苷密闭式微波降解产物中Rg5含量均为最高.密闭式微波降解对原三醇型人参皂苷的转化作用与原二醇型人参皂苷具有相似的规律,人参皂苷Re和Rg1的密闭式微波降解产物中Rh4含量均为最高.本文结果进一步说明在相同的降解条件下,密闭式微波降解法的降解效率远高于高温高压非微波降解法,密闭式微波降解可明显促进常见人参皂苷向稀有人参皂苷转化,因此采用密闭微波技术对常见人参皂苷进行降解可以大量获得稀有人参皂苷.     

人参二醇类皂苷的生物转化动态及人参稀有皂苷C-K或F2的制备

为了低成本有效制备人参稀有皂苷C-K或F₂, 将A. niger g.848菌酶用于转化含有人参皂苷(质量分数)分别为49.6% Rb₁, 25.9% Rd, 19.3% Rc和5.23% Rb₂的西洋参二醇混合皂苷. 霉菌发酵时, 采用人参二醇皂苷诱导物比人参提取液诱导物的产酶总活力提高10%~15%. 所产的2种诱导酶均能水解人参二醇皂苷的3-O-和20-O-多种糖基, 均为人参皂苷酶Ⅰ型; 但是人参二醇皂苷诱导物所产酶几乎全部转化人参二醇皂苷为C-K, 而人参提取液诱导物所产酶则残留中间产物. 使用黑曲霉人参二醇皂苷诱导所产酶, 在转化西洋参二醇皂苷的动态研究中发现, 酶反应1.5~2.5 h, 主要为产物F₂; 酶反应12 h后, 主要产物为C-K皂苷. 基于此, 40 g人参二醇类皂苷在45 ℃粗酶反应24 h, 经处理得到含C-K质量分数为87%的23 g酶反应产物, C-K转化率达85%(摩尔分数). 用40 g西洋参二醇皂苷在45 ℃粗酶反应2.5 h, 经处理得到含有质量分数为58%的F₂和27%的C-K的26 g酶反应产物, F₂转化率为50.4%, C-K转化率为29.5%. 通过人参二醇皂苷诱导的黑曲霉粗酶转化人参二醇类皂苷动态研究, 建立了C-K转化率为85%, F₂转化率为50%的制备方法, 为大批量制备提供了基础依据.     

中药材三七中皂苷类成分的近红外光谱快速无损分析新方法

提出了用近红外漫反射光谱快速无损测定三七中皂苷类成分的新方法采用 HPLC分析了中药材三七固皂昔R_1,人参皂苷Hg_1,Rb_1和Rd的含量,用吸附树脂 比色法测定了三七总皂苷（PNS）的含量,共获得R_1,Bg_1,Rb_1,Rd,PNS的含 量范围分别为1,58-5．08,21,68-46.13,11.46-40.41粉．在3500-1100cm~(-1) 扫描样品,以交叉验证误差均方根（RMsECV）为指标,通过筛选,近红外波段和光 谱预处理方法．采用偏最小二乘算法建立了近红外光谱与5个组分PHLC分析值之间 的校正模型,预测了8个未知样本．R_1,Rg_1,Rb_1,Rd及PNS校正模型的RMSECV 分别为0．40,1.47,1.94,0RMSEP分别为0．53,3．15,2．14,0．70,9．03． 该方法快速无损,结果可靠,为中药材复杂体系中化学组分的测定提供了新的绿色 分析手段．     

高效液相色谱-飞行时间质谱联用法分析人参及人参皂苷与山楂配伍过程中的水解行为

利用高效液相色谱-飞行时间质谱联用的方法,分别对人参配伍山楂前后人参皂苷的变化进行分析,同时对人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd与山楂配伍的水解规律进行系统研究,并与单独煎煮液、仿山楂配伍pH值煎煮液的水解产物进行比较,结果发现人参与山楂配伍后人参皂苷Rg1、Rb1含量明显减少,而人参皂苷Re、Rd、Rg2、Rg3、F2、Rh1含量明显增加,其中人参皂苷Re与山楂配伍后水解产物为人参皂苷20(R)-Rg2、20(S)-Rg2,仿山楂配伍pH值水解产物为人参皂苷20(R)-Rg2、20(S)-Rg2、Rg4、Rg6;人参皂苷Rg1与山楂配伍后水解产物为20(S)-Rh1、20(R)-Rh1,仿山楂pH值水解产物为20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rh4、Rk3;人参皂苷Rb1与山楂配伍后水解产物为Rd、20(S)-Rg3,仿山楂pH值水解产物为F2、20(S)-Rg3;人参皂苷Rd与山楂配伍后水解产物为F2、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3,仿山楂pH值水解产物为20(S)-Rg3、20(R)-Rg3。研究表明,不同人参皂苷和山楂配伍后与仿山楂pH值的水解产物并不相同,人参与山楂配伍改变了人参皂苷成分的种类及含量。本研究为临床方剂中人参与山楂配伍后成分的变化提供物质基础数据。     

人参中达玛烷型皂苷的化学转化产物结构和转化途径研究

利用高效液相色谱-电喷雾-多级串联质谱(HPLC-ESI-MSn)技术分析人参中3种达玛烷型皂苷(三七皂苷R1,人参皂苷Rd、20(S)-Rg3)在12-磷钨酸环境中转化的产物结构和转化途径。由原人参三醇型皂苷R1转化获得9种产物:20(S)-25-OH-R2、20(R)-25-OH-R2、25-OH-T5、20(S)-R2、20(R)-R2、20(S)-25-epoxy-R2、20(R)-25-epoxy-R2、T5、3β,12β-二羟基-6α-(2-O-β-D-吡喃木糖基-β-D-吡喃葡糖氧基)达玛烷-20(22),24-二烯。由原人参二醇型皂苷Rd和20(S)-Rg3转化得到10种产物:20(S)-25-OH-Rg3、20(R)-25-OH-Rg3、25-OH-Rk1、25-OH-Rg5、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、(20S,25)-epoxy-Rg3、(20R,25)-epoxy-Rg3、Rk1、Rg5。通过分析转化产物结构,并考察主要产物含量随转化时间的变化趋势,总结了人参中达玛烷型皂苷在酸性水溶液环境中的转化途径,即通过C20位去糖基化和差向异构化反应,以及烯烃链的水合、脱水、环合反应转化为稀有皂苷。     

邻苯二甲酸酐化学修饰对辣根过氧化物酶催化活性的影响

通过采用邻苯二甲酸酐(PA)对辣根过氧化物酶(HRP)的蛋白链进行修饰, 研究了PA化学修饰对HRP的稳定性、催化活性、活性中心结构、酶对底物的亲合性和专一性等催化性质的影响. 结果显示: 酸性条件下(pH=3), 4小时后PA-HRP的催化活性比天然HRP提高了7.5%;碱性条件下(pH=10), 4小时后PA-HRP的催化活性比天然HRP提高了27%. PA-HRP的K_m值为8.16 (mmol/L), 小于天然HRP的K_m值12.99 (mmol/L), 而PA-HRP的k_(cat)/K_m值为7.86(10~4(L/ mmol· min)大于天然HRP的k_(cat)/K_m的6.70(10~4(L/ mmol· min). 这些催化活性和动力学数据表明了PA-HRP与天然HRP相比其稳定性、酶对底物的亲和性和专一性得到了提高. 紫外-可见光谱、拉曼光谱数据显示: 修饰剂PA 改变了天然HRP血红素周围的微环境, 对酶蛋白分子的活性中心结构并没有影响. 差示光谱显示PA修饰剂可以提高酶对底物的亲和力.     

高效液相色谱法测定竹节参中多种人参皂苷含量

建立了高效液相色谱法(HPLC)测定竹节参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rg2、Rd含量的方法.运用二极管阵列检测器(DAD)峰纯度和光谱检索功能,结合保留时间定性,外标峰面积法定量.采用C18反相柱,以乙腈-水梯度洗脱测定了同一批竹节参总皂苷中人参皂苷Rg1、Re、Rd的含量分别为0.81%、0.15%、2.99%,回收率为93.46%~94.02%,含量及回收率的RSD均小于5%,该方法简便、灵敏,精密度及准确度在允许范围内,可作为竹节参皂苷提取物中多种人参皂苷的同时测定方法.     

人参多糖对人参皂苷Re体内代谢和体外转化的影响

利用快速分离液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪(RRLC/Q-TOF-MS)研究了人参多糖对肠道菌群转化人参皂苷Re的影响;考察了人参皂苷Re的代谢产物Rg1在口服人参多糖大鼠体内的药代动力学,并与正常大鼠体内Rg1的药代动力学参数进行了比较.结果表明,体外肠道菌群转化人参皂苷Re的主要转化产物有人参皂苷Rg1,Rh1,Rg2,F1和原人参三醇(Protopanaxatriol,PPT),分别归属于3条转化路径;正常情况下,肠道菌群转化人参皂苷Re 48 h时,除了终产物PPT的存在,中间产物Rg1,Rg2和F1仍可被检测到,而加入人参多糖后,只检测到终产物PPT.当口服给药Re后,代谢产物Rg1的达峰时间(tmax)、最大血浆浓度(cmax)和血浆药物浓度-时间曲线下面积(AUC)分别为(11.6±6.1) h,(80.1±44.0) ng/m L和(549.3±209.4) ng·h/m L;当给予人参多糖14 d后,口服给药Re,代谢产物Rg1的tmax,cmax和AUC分别为(8.2±5.4) h,(98.2±50.6) ng/m L和(691.9±231.2) ng·h/m L.研究结果表明,人参多糖能促进人参皂苷Re转化为人参皂苷Rg1,进而提高胃肠道对人参皂苷Rg1的吸收,并可能增强人参的药理作用.     

珠子参化学成分分析

从珠子参根茎中分离得到7个化合物. 利用核磁共振、 质谱和红外等手段, 并结合其理化性质, 鉴定了其结构, 它们分别是24(R)-珠子参苷R1, 6-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基]-20-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]-20(S)-原人参三醇、 6″-乙酰基-人参皂苷Rd、 人参皂苷Rf、 竹节参皂苷Ⅳa、 人参皂苷Rd和竹节参皂苷Ⅴ. 其中, 24(R)-珠子参苷R1和6-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基]-20-O-[β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖基]-20(S)-原人参三醇为2个新化合物, 6″-乙酰基-人参皂苷Rd 和人参皂苷Rf为首次从珠子参根茎中得到.     

镧对人参发根中皂苷积累及合成关键酶基因表达的影响

以不同浓度镧处理人参发根, qRT-PCR检测人参皂苷合成关键酶基因PgSS,PgDDS和PgβAS的表达水平, HPLC测定人参皂苷含量,探讨镧对人参发根生长及其人参皂苷合成影响的作用机制。镧浓度分别为5.0, 10.0和15.0 mg·L~(-1)时,促进发根伸长、根毛形成和重量增加, 20.0, 25.0和30.0 mg·L~(-1)时,抑制发根生长;PgSS和PgDDS基因表达水平对镧呈浓度依赖性变化, 20.0 mg·L~(-1)时,PgSS和PgDDS基因表达量均显著增加(P0.05)且达到最大,高于20.0 mg·L~(-1)时,PgSS和PgDDS基因表达水平随镧浓度升高而降低;镧对PgβAS基因表达无明显影响。镧促进发根中人参皂苷Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1和总皂苷含量增加,人参皂苷合成积累规律与PgSS和PgDDS基因表达规律一致,当镧浓度为20.0 mg·L~(-1)时,人参皂苷产量亦达到最高。表明镧可以调节人参发根的生长,通过促进人参皂苷合成关键酶基因PgSS和PgDDS的表达增加人参皂苷的生物合成与积累。     

CYP3A4酶对土茯苓黄酮类成分代谢的影响

以土茯苓6种黄酮类成分为底物,研究了不同孵育时间、不同CYP3A4酶浓度对6种成分代谢的影响。通过土茯苓6种黄酮类成分的酶促动力学,得到米氏常数(K_m)、最大反应速度(V_(max))和代谢清除率(Cl_(int))。结果表明,以表儿茶素、新落新妇苷、落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷、白藜芦醇为底物时,K_m分别为1.39,1.38,2.37,1.59,0.79,2.01μmol/L; V_(max)分别为0.02,0.01,0.02,0.02,0.01,0.02μmol/(L·min); Clint分别为(1.14,0.96,0.90,0.99,1.42,0.97)×10~(-2)min~(-1)。     

动态泡沫浮选法分离富集人参提取液中的二醇型人参皂苷

采用动态泡沫浮选法分离富集人参提取液中的二醇型人参皂苷, 用高效液相色谱法测定6种人参皂苷Rg₁, Re, Rb₁, Rc, Rb₂和Rd的含量. 考察了浮选液pH值、电解质NaCl浓度、载气流量、料液浓度及料液流速对人参皂苷浮选率的影响, 确定了动态泡沫浮选的最佳条件, 并与溶剂提取法、溶剂浮选法以及静态泡沫浮选法进行了比较. 结果表明, 动态泡沫浮选法对二醇型人参皂苷Rb₁, Rc, Rb₂和Rd具有高富集效率, 回收率分别为93.3%, 98.6%, 96.9%和98.3%, 而对三醇型人参皂苷Rg1和Re的富集效率却很低, 回收率分别为4.8%和4.2%. 该法是分离纯化二醇型人参皂苷的一种简便有效的方法.     

微生物酶催化制备人参皂苷20(S)-Rg2,20(S)-Rh1和20(S)-PPT

摘要 人参次级皂苷具有较强的抗癌、抗癌转移等药理活性,但由于在人参中含量少或不存在,因此以人参中含量较高的主要人参皂苷制备药效更高的人参次级皂苷不仅有必要,而且很有意义．本文以微生物Microbacterium esteraromaticum GS514的培养液中分离的粗酶为催化剂水解人参皂苷Re和Rg1,并通过1H NMR和13C NMR谱进行了水解产物的结构表征．实验结果表明,反应体系中无机盐NaCl的存在与否直接影响人参皂苷Re,Rg1与粗酶液的反应结果.人参皂苷与粗酶液直接反应,人参皂苷Re不发生反应,人参皂苷Rg1通过C6所连β-D-吡喃葡萄糖的选择性水解转化成人参皂苷F1.如果该反应是在无机盐NaCl存在下进行,人参皂苷Re通过对C20 所连β-D-吡喃葡萄糖的选择性水解定向转化为20(S)-人参皂苷Rg2;人参皂苷Rg1定向转化成20(S)-人参皂苷Rh1以及20(S)-原人参三醇（PPT）.这说明NaCl的加入激活了C20β-D-吡喃葡萄糖苷酶的活性,这对定向合成不同次级人参皂苷具有重要意义.