红参中原人参三醇型皂苷组在肠道菌群中体外转化及对肠道菌群的作用

采用高分离度快速液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(RRLC-Q-TOF MS)和超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术(UPLC-QQQ MS)对红参中原人参三醇型皂苷组在人肠道菌群中体外代谢转化产物进行定性定量分析,并应用16S rDNA高通量测序技术分析原人参三醇型皂苷组对人肠道菌群多样性的影响。RRLC-Q-TOF MS采用Supelco Ascentis Express C_(18)色谱柱(50 mm×3.0 mm×2.7μm),UPLC-QQQ-MS/MS采用Thermo Syncronis-C_(18)色谱柱(100 mm×2.1 mm×1.7μm),均以0.1%甲酸水-乙腈为流动相进行梯度洗脱,质谱分析均采用电喷雾负离子模式采集。原人参三醇型皂苷组中的人参皂苷Re、Rg1在人肠道菌群孵育后,RRLC-Q-TOF MS通过对照品比对及高分辨质谱数据解析分析转化产物为Rg2、Rh1、F1和PPT。UPLC-QQQ MS定量分析代谢产物的转化率,在代谢转化第60 h时,产物Rg2、Rh1、F1、PPT的生成率为6%、12%、11%和56%。应用Illumina Hiseq 2500平台对粪便样本肠道菌群进行基因测序,与空白组粪便比较,原人参三醇型皂苷组在门水平上显著增加Firmicutes相对丰度,显著降低Bacteroidetes、Proteobacteria相对丰度;在属水平上Prevotella_9、Faecalibacterium、Dialister相对丰度显著增加,显著降低Escherichia-Shigella、Dorea、Lachnoclostridium相对丰度。该研究为基于肠道菌群对原人参三醇型皂苷药效物质基础的确定和药效作用靶点提供依据。     

人参皂苷Re在正常和中波紫外线辐射损伤模型大鼠体内药代动力学比较研究

建立了超高效液相色谱-三重四级杆质谱(UPLC-QQQ-MS)检测大鼠血浆中G-Re含量的方法,用于比较研究人参皂苷Re(Ginsenoside Re,G-Re)在正常大鼠和UVB辐射损伤模型大鼠体内的药代动力学行为。选用Ascentis~? Express C_(18)色谱柱(5.0 mm×3.0 mm,2.7μm),以0.1%甲酸-乙腈为流动相,梯度洗脱。电喷雾离子源(ESI)在负离子模式下,选择多反应监测模式(MRM)扫描,内标法定量,用于G-Re定量分析的离子为m/z 991.54/945.53/475.60。方法检出限为4.0 ng/m L,定量限为13.5 ng/m L,G-Re在15~20000 ng/m L范围内线性关系良好(r=0.999);日内和日间精密度、回收率、基质效应和稳定性均能满足药代动力学分析要求。结果表明,两组大鼠分别单次口服50 mg/kg G-Re后,体内代谢过程表现皆符合二室模型特征,正常组和模型组t_(1/2α)分别为(0.21±0.04)h和(0.69±0.07)h,t_(1/2β)分别为(17.08±0.53)h和(21.40±16.77)h,AUC_((0-t))分别为(321.91±2.27)"g/(L·h)和(474.99±194.96)"g/(L·h),AUC_((0-∞))分别为(332.44±1.66)"g/(L·h)和(518.64±231.39)"g/(L·h),除t_(1/2α)外,两组之间的药代动力学参数具有显著差异(p0.05)。本方法准确、灵敏、专属性强、稳定性好,可用于人参皂苷Re的体内药代动力学比较研究。     

稀有原人参二醇型皂苷的人肠道菌群生物转化

利用高分离度液相色谱-四极杆飞行时间质谱(RRLC-Q-TOF MS)和超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-QQQ MS)定性定量分析了稀有原人参二醇型皂苷Rd, F₂, Rg₃, CK和Rh₂在离体人肠道菌群中的生物转化过程. 并将上述二醇型皂苷与人肠道菌群在体外厌氧, 37 ℃下共温孵育, 采用电喷雾质谱在负离子模式进行检测, 鉴定代谢产物, 监测其含量变化, 拟合代谢路径. 结果表明, 人参皂苷Rd主要被代谢为F₂, Rg₃, CK, Rh₂和PPD; 人参皂苷F₂主要被代谢为CK和PPD; 人参皂苷Rg₃主要被代谢为Rh₂和PPD; 人参皂苷CK和Rh₂主要被代谢为PPD. 在离体条件下, 人参皂苷Rd, F₂和Rg₃会被肠道菌群完全转化为其代谢产物, 而人参皂苷CK和Rh₂则不能被肠道菌群完全转化为其代谢产物. 原人参二醇型皂苷在人肠道菌群中的主要转化为脱糖基反应, 单糖苷和苷元是稀有原人参二醇型皂苷在人体内发挥药效的物质基础.     

密闭式微波降解法促进常见人参皂苷向稀有人参皂苷转化的规律

采用密闭微波技术对7种常见人参皂苷单体(Rb1,Rb2,Rb3,Rc,Rd,Re和Rg1)进行降解,通过高效液相色谱(HPLC)分析并与相同条件下非微波降解物对比,研究了密闭微波降解人参皂苷的产物在化学结构及组成上的变化规律,以期快速、高效地制备生物活性高的稀有人参皂苷.结果表明,密闭式微波降解法能够使常见人参皂苷基本降解完全,而相同条件下非微波降解法则基本不发生降解.原人参二醇型人参皂苷易水解掉C20位糖,并发生C20位构型变化,生成20(R)-Rg3和20(S)-Rg3,其中20-(R)为优势构型,C20位羟基进一步脱水产生稀有人参皂苷Rk1和Rg5.同时,20(S/R)-Rg3失去C3位的1分子葡萄糖转化为20(S/R)-Rh2,C20位羟基再进一步脱水生成了Rk2和Rh3.此外,人参皂苷C20位所连的糖种类与构型影响了降解产物中各稀有皂苷的组成与比例,但7种原人参二醇型人参皂苷密闭式微波降解产物中Rg5含量均为最高.密闭式微波降解对原三醇型人参皂苷的转化作用与原二醇型人参皂苷具有相似的规律,人参皂苷Re和Rg1的密闭式微波降解产物中Rh4含量均为最高.本文结果进一步说明在相同的降解条件下,密闭式微波降解法的降解效率远高于高温高压非微波降解法,密闭式微波降解可明显促进常见人参皂苷向稀有人参皂苷转化,因此采用密闭微波技术对常见人参皂苷进行降解可以大量获得稀有人参皂苷.     

微生物酶催化制备人参皂苷20(S)-Rg2,20(S)-Rh1和20(S)-PPT

摘要 人参次级皂苷具有较强的抗癌、抗癌转移等药理活性,但由于在人参中含量少或不存在,因此以人参中含量较高的主要人参皂苷制备药效更高的人参次级皂苷不仅有必要,而且很有意义．本文以微生物Microbacterium esteraromaticum GS514的培养液中分离的粗酶为催化剂水解人参皂苷Re和Rg1,并通过1H NMR和13C NMR谱进行了水解产物的结构表征．实验结果表明,反应体系中无机盐NaCl的存在与否直接影响人参皂苷Re,Rg1与粗酶液的反应结果.人参皂苷与粗酶液直接反应,人参皂苷Re不发生反应,人参皂苷Rg1通过C6所连β-D-吡喃葡萄糖的选择性水解转化成人参皂苷F1.如果该反应是在无机盐NaCl存在下进行,人参皂苷Re通过对C20 所连β-D-吡喃葡萄糖的选择性水解定向转化为20(S)-人参皂苷Rg2;人参皂苷Rg1定向转化成20(S)-人参皂苷Rh1以及20(S)-原人参三醇（PPT）.这说明NaCl的加入激活了C20β-D-吡喃葡萄糖苷酶的活性,这对定向合成不同次级人参皂苷具有重要意义.     

LC-MS/MS法测定大鼠血浆中人参皂苷Rb1的含量及其药代动力学研究

采用液相色谱-串联质谱法快速、灵敏地测定大鼠血浆中人参皂苷Rb1(GRb1)的含量,并将该方法应用于大鼠口服GRb1后的代谢动力学研究。血浆样品采用96孔板进行液-液萃取后,应用Agilent SB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,3.5μm)进行分离,以甲醇-0.1%甲酸溶液(体积比为75∶25)为流动相进行洗脱,在正离子模式下对GRb1和内标人参皂苷Rg1(GRg1)进行检测,用于定量的离子反应分别为1131.5→365.1(GRb1),823.3→643.4(GRg1)。人参皂苷Rb1血浆样品测定方法的定量线性范围为1~500 ng/mL,线性相关系数大于0.999,定量下限为1 ng/mL,批内和批间精密度(RSD)小于9.05%,回收率为79.7%~81.0%,基质效应为96.6%~99.3%。大鼠灌胃给予Rb15 mg/kg后,大鼠体内血药浓度到达高峰时间tmax为1.53 h,半衰期t1/2为13.54 h,药时曲线面积AUC0~72为16237.76(ng·h)/mL。该方法快速、高效、灵敏,适用于人参皂苷Rb1的代谢动力学研究。     

人参中人参皂苷的直接高压微波辅助降解

采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用法测定了人参提取液中的人参皂苷. 考察了天然人参皂苷发生降解的条件, 同时研究了单体人参皂苷Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2和Rd的降解, 并对降解产物进行了分析. 结果表明, 随着提取压力的升高, 提取液中天然人参皂苷的含量逐渐减少, 同时产生多种次级人参皂苷. 当微波提取压力达到600 kPa, 提取时间为10 min时, 提取液中的主要天然人参皂苷达到完全降解, 次级人参皂苷Rg3含量达到最高. 在单体人参皂苷Rb1, Rc, Rb2和Rd的降解产物中均得到人参皂苷Rg3.     

高效液相色谱法快速测定参芪降糖胶囊中人参皂苷的含量

建立了高效液相色谱法快速测定参芪降糖胶囊中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd含量的方法.采用3.5μm Coreshell C18核壳型分离填料(3.0 mm×150 mm)为色谱柱,分别以纯乙腈、纯水为流动相进行梯度淋洗,流量为0.43 mL/min,柱箱温度为25℃,检测波长为203 nm.人参皂苷Rg1、...     

高效液相色谱-飞行时间质谱联用法分析人参及人参皂苷与山楂配伍过程中的水解行为

利用高效液相色谱-飞行时间质谱联用的方法,分别对人参配伍山楂前后人参皂苷的变化进行分析,同时对人参皂苷Re、Rg1、Rb1、Rd与山楂配伍的水解规律进行系统研究,并与单独煎煮液、仿山楂配伍pH值煎煮液的水解产物进行比较,结果发现人参与山楂配伍后人参皂苷Rg1、Rb1含量明显减少,而人参皂苷Re、Rd、Rg2、Rg3、F2、Rh1含量明显增加,其中人参皂苷Re与山楂配伍后水解产物为人参皂苷20(R)-Rg2、20(S)-Rg2,仿山楂配伍pH值水解产物为人参皂苷20(R)-Rg2、20(S)-Rg2、Rg4、Rg6;人参皂苷Rg1与山楂配伍后水解产物为20(S)-Rh1、20(R)-Rh1,仿山楂pH值水解产物为20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rh4、Rk3;人参皂苷Rb1与山楂配伍后水解产物为Rd、20(S)-Rg3,仿山楂pH值水解产物为F2、20(S)-Rg3;人参皂苷Rd与山楂配伍后水解产物为F2、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3,仿山楂pH值水解产物为20(S)-Rg3、20(R)-Rg3。研究表明,不同人参皂苷和山楂配伍后与仿山楂pH值的水解产物并不相同,人参与山楂配伍改变了人参皂苷成分的种类及含量。本研究为临床方剂中人参与山楂配伍后成分的变化提供物质基础数据。     

在线二维柱切换高效液相色谱法同时测定牙膏中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1

使用双梯度液相色谱系统紫外检测器,建立了二维液相色谱法全自动快速同时测定牙膏中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1的含量。样品经超声提取后,以Syncronis C18为一维分析柱,ODS C18为二维分析柱,利用一维色谱柱完成三七皂苷R1和人参皂苷Rb1分离测定以及人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的净化;利用二维色谱柱完成人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的分析。一维分析和二维分析均以乙腈-水体系作为流动相,梯度洗脱,检测波长为203 nm,整个分析过程仅需30 min。三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、Re 和 Rb1在0.5~200 mg/L范围内线性良好,相关系数R2分别为0.9994,0.9996,0.9995和0.9994,平均回收率均在86.4％~95.1％之间。本方法简便快速,测定结果准确可靠,可用于牙膏中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re和Rb1含量的测定。     

高效液相色谱法测定竹节参中多种人参皂苷含量

建立了高效液相色谱法(HPLC)测定竹节参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rg2、Rd含量的方法.运用二极管阵列检测器(DAD)峰纯度和光谱检索功能,结合保留时间定性,外标峰面积法定量.采用C18反相柱,以乙腈-水梯度洗脱测定了同一批竹节参总皂苷中人参皂苷Rg1、Re、Rd的含量分别为0.81%、0.15%、2.99%,回收率为93.46%~94.02%,含量及回收率的RSD均小于5%,该方法简便、灵敏,精密度及准确度在允许范围内,可作为竹节参皂苷提取物中多种人参皂苷的同时测定方法.     

加压毛细管电色谱-微流蒸发光散射检测器联用系统的构建及其应用

构建微流蒸发光散射检测器(μELSD)与加压毛细管电色谱(pCEC)联用系统,测定中药提取物注射用血塞通(冻干)中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1,Re,Rb1、Rd考察系统的实用性和稳定性。用C18毛细管色谱柱,通过对流动相体系、梯度洗脱条件、雾化载气流速、蒸发温度、施加电压等参数的优化,确定了注射用血塞通(冻干)5种成分含量测定的最佳测定参数。最佳测定参数如下,流动相A为15 mmol/L甲酸-三乙胺乙腈溶液(pH=7.0),流动相B为15 mmol/L甲酸-三乙胺溶液(pH=7.0);梯度洗脱条件:0~10 min,19%A;10~30 min,22%A;30~35 min,36%A;35~45 min,40%A。雾化载气流速2 L/min;蒸发温度120℃;施加电压+8 kV。5种成分线性范围为8.6~146.9 ng(三七皂苷R1)、6.9~189.7 ng(人参皂苷Rg1)、6.8~171.4 ng(人参皂苷Re)、9.4~156.1 ng(人参皂苷Rb1)、7.5~180.5 ng(人参皂苷Rd),5种成分回收率都在95%~105%之间。实验表明,构建的pCEC-μELSD联用系统能用于药物中有效成分的含量测定。μELSD的构建为毛细管液相色谱、毛细管电色谱和毛细管电泳分离技术提供了一种全新的检测手段。     

胶束电动毛细管色谱法同时测定西洋参中人参皂苷Rg1、Re和Rb1

建立了西洋参中人参皂苷Rg1、Re及Rb1同时分离测定的胶束电动毛细管色谱新方法,以解决西洋参样品中难溶于水的3种人参皂苷的准确定量问题。以40.2 cm(有效长度30 cm)×50 μm的熔融石英毛细管柱为分离柱,分离缓冲液的组成为V(15 mmol/L Na2B4O7+30 mmol/L H3BO3 (pH 9.0)+100 mmol/L十二烷基硫酸钠(SDS)+30 g/L聚乙二醇35000):V(甲醇):V(异丙醇)=2:1:1,于214 nm下检测。详细研究了影响分离的因素。Rg1、Re及Rb1检出限(信噪比(S/N)为3)分别为30、40及30 mg/L,定量限(S/N=9)分别为90、120及90 mg/L,加标回收率为87.4%～95.2%。用该法测定了西洋参标准物质,并与高效液相色谱法的检测结果进行了比对,结果吻合。应用该方法分别测定了中国、加拿大及美国的西洋参,获得满意的结果。     

超高效液相色谱法测定参麦注射液中间产品中的人参皂苷Rg_1、Re和Rb_1

采用超高效液相色谱法测定参麦注射液中间产品中的人参皂苷Rg1、Re和Rb1。参麦注射液中间产品经0.2μm滤膜过滤,以ACQUITY UPLC shield BEH RP18色谱柱为分离柱,以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱,紫外检测波长为203nm。人参皂苷Rg1、Re和Rb1的质量浓度在0.081 8~0.409 2g·L-1范围内与峰面积呈线性关系,检出限(3S/N)分别为0.652,0.479,0.916mg·L-1。加标回收率在99.9%~100%之间,测定值的相对标准偏差(n=9)在0.47%~0.64%之间。     

基于HPLC-HRMS/MS~n/QqQ技术的人参皂苷Rb_1化学转化产物的结构与途径分析

利用液相色谱-质谱联用技术分析了Keggin型12-磷钨酸化学转化人参皂苷Rb1产物的结构与转化途径.基于高效液相色谱对转化产物的快速分离,利用Q Exactive高分辨质谱的Full MS-AIF模式快速鉴定了产物结构,并利用多级串联质谱进行结构验证.进一步结合人参皂苷异构体在反向C18色谱柱上的相对保留时间,快速分析鉴定出Rb1的10种转化产物为20(S)-Rg3,20(R)-Rg3,20(S)-25-OH-Rg3,20(R)-25-OH-Rg3,25-OH-Rk1,25-OH-Rg5,Rg5,Rk1,(20S,25)-环氧-Rg3和(20R,25)-环氧-Rg3.根据转化产物的结构初步推断了人参皂苷的转化途径:在12-磷钨酸产生的酸性环境中,Rb1主要通过C20位去糖基化、差向异构化和烯烃链的水合、消除及环合反应转化为稀有皂苷.采用三重四极杆质谱的选择反应监测模式准确定量分析了Rb1的转化效率和稀有皂苷20(S)-Rg3,20(R)-Rg3,Rk1和Rg5的产率.定量分析结果显示,与生物转化相比,12-磷钨酸对Rb1有更高的转化效率,反应40 min后转化率达到100%.本文结果表明,HPLC-HRMS/MSn/Qq Q技术是人参皂苷等天然产物结构解析与定量分析的有效方法.     

人参二醇类皂苷的生物转化动态及人参稀有皂苷C-K或F2的制备

为了低成本有效制备人参稀有皂苷C-K或F₂, 将A. niger g.848菌酶用于转化含有人参皂苷(质量分数)分别为49.6% Rb₁, 25.9% Rd, 19.3% Rc和5.23% Rb₂的西洋参二醇混合皂苷. 霉菌发酵时, 采用人参二醇皂苷诱导物比人参提取液诱导物的产酶总活力提高10%~15%. 所产的2种诱导酶均能水解人参二醇皂苷的3-O-和20-O-多种糖基, 均为人参皂苷酶Ⅰ型; 但是人参二醇皂苷诱导物所产酶几乎全部转化人参二醇皂苷为C-K, 而人参提取液诱导物所产酶则残留中间产物. 使用黑曲霉人参二醇皂苷诱导所产酶, 在转化西洋参二醇皂苷的动态研究中发现, 酶反应1.5~2.5 h, 主要为产物F₂; 酶反应12 h后, 主要产物为C-K皂苷. 基于此, 40 g人参二醇类皂苷在45 ℃粗酶反应24 h, 经处理得到含C-K质量分数为87%的23 g酶反应产物, C-K转化率达85%(摩尔分数). 用40 g西洋参二醇皂苷在45 ℃粗酶反应2.5 h, 经处理得到含有质量分数为58%的F₂和27%的C-K的26 g酶反应产物, F₂转化率为50.4%, C-K转化率为29.5%. 通过人参二醇皂苷诱导的黑曲霉粗酶转化人参二醇类皂苷动态研究, 建立了C-K转化率为85%, F₂转化率为50%的制备方法, 为大批量制备提供了基础依据.     

电喷雾质谱法研究人参皂苷与溶菌酶的相互作用

用电喷雾质谱法研究了溶菌酶与人参皂苷Rg1和Re的非共价相互作用。非共价复合物的解离常数可以由溶菌酶和复合物的峰高直接计算得到。由各个体系得到的溶菌酶与Rg1和Re的一级解离常数KD, 1是一致的，但是二级解离常数KD, 2的差别较大。由此可以推断出复合物的峰高越强，结果的精密度越好。当固定溶菌酶的浓度不变时，复合物的解离常数会随着人参皂苷的浓度的增加而略微的增大。而当固定人参皂苷的浓度时，复合物的解离常数会随着溶菌酶的浓度的增加而减小。计算结果还证明了人参皂苷Rg1与溶菌酶的结合能力大于Re。     

HPLC测定中药渣中人参皂苷Rg_1、Re与Rb_1含量

建立了一种利用反相高效液相色谱检测中药渣中人参皂苷Rg_1、Re和Rb_1含量的分析方法。考察了提取试剂、提取温度、提取溶剂倍量、提取时间对提取效果的影响,最终将样品以10倍体积的70%甲醇于40℃水浴中超声提取0.5 h。采用Zorbax SB-C_(18)(4.6 mm×150 mm,5μm)柱分离,以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 m L/min,进样量为20μL,柱温为20℃,检测波长为203 nm,采用外标法定量。在该条件下,人参皂苷Rg_1、Re、Rb_1分别在18.74~257.61、37.48~468.54、3.88~96.93 mg/L范围内线性关系良好(r~20.999)。人参皂苷Rg_1、Re和Rb_1的定量下限(S/N=10)分别为17.69、13.94、1.14 mg/L。3个不同浓度的加标回收率为89.1%~107%,相对标准偏差(RSD,n=3)为0.6%~4.1%。该方法具有操作简便快捷、检测灵敏度高等特点。     

液相色谱-质谱联用技术结合多探针底物法研究人参皂苷Rb1的体外代谢

以奥美拉唑、 苯妥英、 卡马西平和非那西丁为检测肝药酶细胞色素P450酶(CYP450)亚型的专属探针药物, 通过原型药物减少量测定法考察药物体外代谢的变化, 评价人参皂苷Rb1对CYP450不同亚型酶的作用. 结果表明, P2C9, P2C19和P3A4实验组与对照组差异不显著, P1A2实验组与对照组差异显著, 表明人参皂苷Rb1能诱导P1A2亚型酶的活性, 促进底物与酶反应, 加快底物的代谢, 而对P2C9, P2C19和P3A4三个亚型酶有弱的诱导或无诱导作用. 根据快速分离液相色谱-质谱联用(RRLC-MS/MS)检测结果推断, 人参皂苷Rb1在CYP450酶中的代谢产物可转化为人参皂苷Rb1氧化产物(Rb1+O)及人参皂苷Rd和F2.     

动态泡沫浮选法分离富集人参提取液中的二醇型人参皂苷

采用动态泡沫浮选法分离富集人参提取液中的二醇型人参皂苷, 用高效液相色谱法测定6种人参皂苷Rg₁, Re, Rb₁, Rc, Rb₂和Rd的含量. 考察了浮选液pH值、电解质NaCl浓度、载气流量、料液浓度及料液流速对人参皂苷浮选率的影响, 确定了动态泡沫浮选的最佳条件, 并与溶剂提取法、溶剂浮选法以及静态泡沫浮选法进行了比较. 结果表明, 动态泡沫浮选法对二醇型人参皂苷Rb₁, Rc, Rb₂和Rd具有高富集效率, 回收率分别为93.3%, 98.6%, 96.9%和98.3%, 而对三醇型人参皂苷Rg1和Re的富集效率却很低, 回收率分别为4.8%和4.2%. 该法是分离纯化二醇型人参皂苷的一种简便有效的方法.