基于荧光共振能量转移的核酸适配体传感器检测环丙沙星

建立了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的核酸适配体传感器,并用于检测实际水体和牛奶中的环丙沙星（CIP）。为了防止羧基荧光素（FAM）被CIP猝灭,FAM和四甲基罗丹明（TAMRA）分别标记在互补单链DNA(FAM-cDNA)和适配体（TAMRA-APT）,通过DNA杂交发生FRET, TAMRA有效猝灭FAM的荧光。CIP加入后,其与FAM-cDNA发生亲和力竞争反应,CIP与TAMRA-APT形成结构更稳定的CIP/TAMRA-APT复合物,使体系FAM的荧光恢复。在优化条件下,本方法对CIP表现出高灵敏度和高选择性,检测浓度线性范围为0.01～1μmol/L,检出限为6 nmol/L;对实际水样和牛奶的加标回收率为90.4%～113.2%,相对标准偏差为1.8%～11%。该荧光适配体传感器具有成本低、灵敏度高、特异性好等优点,在环境中CIP残留快速检测方面具有良好的应用潜力。     

基于CRISPR/Cas技术的传染性病原精准便携化检测系统

以核酸为检测靶向的分子诊断方法是传染性病原体检测的金标准,但将其应用于便携化或现场快速诊断时仍存在多种限制和挑战,如特异性差、操作繁琐和便携化难等。规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）-荧光检测方法有望大幅提升核酸识别的特异性和信噪比。本研究开发了环介导等温扩增（LAMP）-CRISPR/Cas-便携化灰度读取仪检测系统。在CRISPR RNA (crRNA)存在下,利用CRISPR/Cas12a体系实现了对自主设计的甲型和乙型流感病毒核酸LAMP扩增反应体系的精准荧光检测,验证了CRISPR/Cas体系的高选择性和通用性。配套自主开发的便携化灰度读取仪,可同时实现荧光信号的低成本采集和高可靠性可视化判读,检测结束后直接输出样品的阳/阴性结果。利用本检测系统对实际样本进行了分析,验证了其可靠性和实用性,证明了本系统能够实现流感病毒的高灵敏、高特异性便携化分析。     

基于CRISPR-Cas12a与G-四链体构建免标记电化学生物传感器检测microRNA

CRISPR-Cas12a是一种功能强大且可编程的分子诊断技术。本文基于CRISPR-Cas12a的附属切割活性与G-四链体/氯化血红素（Hemin）复合物,设计了一个免标记电化学生物传感器,实现对miRNA的强特异性检测。靶标miRNA-21与双链DNA探针上的Toehold区域结合并发生链置换反应,置换出双链DNA探针中较短的DNA。置换下来的DNA可以有效地激活CRISPR-Cas12a的附属切割活性。随后,具有附属切割活性的Cas12a切割电极表面上形成G-四链体/Hemin的DNA序列,导致电流信号减弱。在最优条件下,电流信号强度变化与10～100 pmol/L范围内的miRNA-21浓度呈良好的线性关系,检出限为4.2 pmol/L。该电化学生物传感器能够实现对单个碱基突变的miRNA-21或其它miRNA序列特异性识别,并可用于人血清样本（10%）中miRNA-21的检测。     

基于核酸外切酶Ⅲ信号放大技术的荧光适配体传感器用于卡那霉素的检测

建立了一种基于核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)和碳纳米颗粒(CNPs)的信号放大体系用于卡那霉素(KAN)检测的新方法。合成了水溶性的CNPs,并设计合成了不同序列的DNA,具体包括:卡那霉素适配体(Apt),羧基荧光素标记的信号DNA探针(FAM-DNA)和互补链cDNA。当体系中不存在KAN时,Apt与cDNA可以杂交形成双链DNA,体系中FAM-DNA处于单链状态,Exo Ⅲ不能水解单链DNA;此时,体系中加入CNPs,单链FAM-DNA被CNPs吸附,荧光发生淬灭;在KAN存在下,Apt与其靶标KAN特异性结合,此时FAM-DNA与cDNA杂交形成双链DNA,由于CNPs对双链DNA吸附较弱,DNA探针的荧光不发生淬灭。ExoⅢ可以特异性的从3’-端对FAM-DNA降解,释放FAM荧光团和cDNA,该体系通过"降解-杂交"循环,最终释放出大量的FAM荧光团。由于CNPs对FAM具有较低的亲和力,释放出的FAM不能吸附在CNPs表面,FAM荧光不会发生淬灭,实现荧光信号放大扩增作用。方法线性范围为50～100 nmol/L,检测限为2.5 nmol/L。该方法可用于实际样品牛奶中卡那霉素的检测。     

双链特异性核酸酶介导的高灵敏度microRNA分析

基于氧化石墨烯(GO)对荧光标记单链DNA探针的荧光猝灭效应以及双链特异性核酸酶(DSN)选择性切割DNA/RNA杂合结构中DNA单链的特性,本文建立了一种新型恒温信号放大方法用于microRNA(miRNA)的高灵敏度检测.靶标miRNA首先与荧光DNA探针杂交,DSN能够特异性地将杂合双链中的DNA探针水解为碎片但不会降解miRNA,GO对酶切产生的寡核苷酸碎片吸附能力显著降低,使得荧光基团远离GO表面而不被猝灭.释放出的miRNA可再次发生与荧光DNA探针杂交、DSN酶切等反应,如此反复,可实现恒温条件下一个miRNA分子与多个探针杂交、酶切、释放荧光基团的循环过程,最终体系的荧光信号得到显著放大,通过记录体系的荧光信号即可实现对靶标miRNA的灵敏检测.     

基于CRISPR/Cas的生物传感器在食源性病原菌检测中的应用进展

食源性病原菌严重威胁食品安全及消费者的健康,因此,对食源性病原菌快速、准确的检测方法对保障食品安全尤为重要。规则成簇的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/CRISPR相关系统（CRISPR-associated systems, Cas）生物传感器是在引导核糖核酸（RNA）的作用下,使Cas蛋白与RNA形成RNA复合体,并对靶标基因进行特异性识别,从而将靶标信号转化为可检测的物理和化学信号。CRISPR/Cas生物传感器具有特异性好、可编程以及使用简便等优势,在病原菌检测领域具有广阔的应用前景。本文根据Cas蛋白的种类和作用机制不同,分别介绍了不同CRISPR/Cas系统的作用原理和特点,概述了基于不同CRISPR/Cas的生物传感的信号识别、信号放大、信号输出策略及其在食源性病原菌检测中的应用进展,讨论了基于CRISPR/Cas的多重生物传感器的构建原理及其在多病原菌同时检测中的应用,分析了基于CRISPR/Cas的生物传感器在病原菌快速检测中面临的挑战及未来的发展趋势。     

时间分辨光谱技术研究亚甲基蓝与小牛胸腺DNA的相互作用

采用时间分辨光谱技术研究了亚甲蓝与小牛胸腺DNA（MB-ctDNA）重水混合体系中MB敏化单态氧（1O2）动力学过程,以此进一步探讨MB与DNA的相互作用。结果表明显示,低浓度ctDNA和高浓度ctDNA的单态氧磷光动力学曲线有着明显不同,这些差异被归结为MB与DNA间结合方式和作用机制的改变。在低浓度ctDNA条件下,MB分子和ctDNA之间形成离子型结合物,MB的吸收带出现显著的减色效应,敏化1O2产量随DNA浓度增加而急剧下降,但ctDNA与1O2没有发生明显的相互作用;而在高浓度DNA时,MB分子和ctDNA之间的相互作用方式转变为以嵌入式结合为主,激发态MB与ctDNA间的能量转移和介质的粘度效应,改变了1O2的动力学特性,大大降低了光敏剂MB敏化1O2的产量,但1O2不为ctDNA所猝灭。这些结果阐明,在MB与DNA的混合体系中,敏化单态氧损坏DNA的Ⅱ型反应不是主要的PDT作用机制。     

富含胞嘧啶单链DNA-银纳米簇荧光探针用于S1核酸酶的灵敏检测

以富含胞嘧啶（C）的单链DNA为模板合成银纳米簇,将其作为功能化探针,建立了一种无标记荧光检测S1核酸酶的方法.S1核酸酶可以特异性识别单链DNA,在最适的酶催化反应条件下,可将其降解为单核苷酸或寡核苷酸片段.当S1核酸酶不存在时,富含C的单链DNA可以有效地合成荧光银纳米簇;当S1核酸酶存在时,单链DNA模板被特异性识别并降解,导致无法形成银纳米簇,使体系荧光信号降低.实验结果表明,银纳米簇的荧光强度随着S1核酸酶浓度的增加而降低.在优化的条件下,体系荧光信号（F/F₀）与S1核酸酶的浓度在5.0×10^-5~4.0×10^-3 U/μL范围内呈线性关系,检出限为2.0×10^-6 U/μL.该荧光探针选择性好,可用于RPMI 1640细胞培养基中S1核酸酶的检测,回收率达到91.8%~109.5%.     

不同结构的DNA激活序列对Cas12a反式切割活性的影响

CRISPR－Cas12a系统的反式切割活性在其识别特定的DNA激活序列后被激活,这不仅能实现特定DNA靶标的直接定量分析,同时也为构建针对多种生物标志物的体外传感体系带来了新的思路。然而,已有文献中所采用的双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）激活序列结构多种多样,缺乏全面、系统的设计指导原则。针对该问题,该文系统研究了不同结构的DNA激活序列对LbaCas12a反式切割活性的影响。通过对比研究,得出以下结论：（1）前间区序列邻近基序（PAM）位点有助于LbaCas12a更高效地靶向结合dsDNA激活序列和ssDNA激活序列;（2）PAM近端区域缺少序列片段会降低Cas12a-crRNA定位激活序列的效率;（3）删除PAM远端序列片段有利于增强LbaCas12a的反式切割活性;（4）由于省略了dsDNA解链过程,ssDNA激活序列在激活LbaCas12a的反式切割活性方面普遍比dsDNA激活序列产生的效果更好。根据这些发现,该文提出了一种LbaCas12a所青睐的高效激活序列结构,其激活的LbaCas2a反式酶切活性较采用含PAM位点的标准dsDNA激活序列高出3.7倍。研究结果为构建基于CRISPR-Cas12a的高效体外生物传感系统提供了重要支撑。     

基于磁珠和双链特异性核酸酶辅助目标循环技术构建荧光传感器用于MicroRNA的检测

基于磁珠(MBs)的分离富集和双链特异性核酸酶(DSN)选择性切割DNA单链的特性,建立了信号增强型荧光生物传感器用于microRNA-21(miR-21)的检测。荧光素(FAM)修饰的捕获探针(Cps),通过亲和素-生物素的特异识别作用固定在磁珠表面。当miR-21存在时,Cps与其杂交形成DNA/RNA双螺旋结构,DSN能特异性水解杂合双链中的DNA,同时释放出荧光标记片段和完整的miR-21。被释放出来的miR-21与另一Cp再次杂交并被DSN酶切,如此循环,从而实现恒温条件下一个miR-21与多个Cp杂交、酶切,释放出大量的荧光标记片段的循环过程,最终使体系的荧光强度明显变大。相反,当miRNA-21不存在时,Cps无法形成双螺旋结构,DSN对单链DNA无酶切作用,不能水解Cps,经磁分离,上清液没有荧光标记片段,所以检测不到荧光信号。最佳条件下,miR-21浓度在100~5×104fmol/L范围内,荧光强度与其浓度呈良好的线性关系,检测限达80 fmol/L。该传感器可以识别单碱基错配序列,有望为肿瘤早期诊断提供新思路。     

基于核酸切割酶与脱氧核酶的荧光循环放大系统检测铅(Ⅱ)

利用核酸切割酶(Nicking endonuclease)识别特定DNA双链并切割其中某条单链的性质,构建了基于8-17E脱氧核酶(8-17E DNAzyme)的pb2+荧光循环放大检测方法.pb2+可激活8-17E脱氧核酶水解RNA底物,产生并释放出的单链与分子信标探针( Molecular beacon,MB)杂交,导致其茎环结构被破坏,荧光信号恢复;同时形成含有核酸切割酶Nt.BbvCI识别位点的双链区域.在核酸切割酶Nt.BbvCI的作用下,分子信标探针被切割释放,游离出来的单链可与其它分子信标重新杂交,从而触发下一轮酶切,引起荧光检测信号的循环放大.本方法避免了8-17E脱氧核酶与底物链的修饰,最低可以检测出水溶液中1.0×10-10 mol/L Pb2+,并在2倍浓度的Zn2+,以及5倍浓度的其它干扰金属离子存在的情况下对pb2+显示出良好的选择性.本方法对环境水样中pb2+的标准加样回收率为96.1％～108.0％.     

基于双重猝灭原理的分子信标定量检测凝血酶

利用G碱基和有机猝灭基团对荧光基团的双重猝灭作用构建了分子信标,建立了一种基于双重猝灭原理的检测凝血酶的简单方法.此分子信标中荧光基团设计为羧基荧光素(FAM),有机猝灭基团设计为Black Hole Quencher 1(BHQ-1),BHQ-1连接3个含有G碱基的核苷酸,分子信标的环设计为凝血酶的核酸适配体.体系中没有凝血酶时,分子信标呈茎环结构,荧光基团FAM与有机猝灭基团BHQ-1及G碱基相互靠近,FAM的荧光在BHQ-1及G碱基的双重猝灭下,其荧光信号很弱;当体系中有凝血酶存在时,分子信标与凝血酶特异性结合,形成G-四联体结构,茎-环结构被破坏,FAM远离猝灭基团BHQ-1及G碱基,其荧光得到恢复.在最适条件下,体系的荧光强度(△I)与凝血酶的浓度(C)在0.4~40 nmol/L范围内具有良好的线性关系,线性回归方程为△I=24.63C(nmol/L)+13.06(R2=0.9972),检出限为0.18 nmol/L(3σ,n=9).实际血样加标回收率为96.3%~98.7%.     

基于核酸外切酶Ⅲ辅助信号放大的荧光法检测四环素

以核酸适配体作为识别单元、核酸外切酶Ⅲ(EXO Ⅲ)作为信号放大元件以及氧化石墨烯(GO)作为信号开关的荧光传感器来检测四环素(TC)。当体系中没有TC存在时,四环素适配体与其互补链(c DNA)杂交形成双链,EXO Ⅲ不能切割5'端标记有荧光基团的单链信号链(SP),加入GO后,信号链被吸附至GO表面并发生荧光淬灭。当体系中有TC存在时,核酸适配体能够识别并且结合TC,促使c DNA与SP链形成双链,这将诱导EXO Ⅲ从信号链3'端对c DNA-SP双链进行切割,释放出荧光基团,游离的荧光基团不能被GO吸附而淬灭,通过连续的酶促切割,得到更多的游离荧光基团,从而使得荧光信号明显增强。建立的荧光法对TC具有较高选择性,检测限(LOD)为671 pmol/L,方法已用于自来水样品中TC的测定。     

基于氧化石墨烯识别特定双螺旋DNA

依据三螺旋DNA的形成,以氧化石墨烯为基础建立了一种识别特定序列双螺旋DNA的方法。单链探针DNA能够通过静电引力作用吸附在氧化石墨烯表面,标记在单链DNA末端的荧光探针分子TAMRA由于荧光能量共振转移作用使得其荧光发生淬灭。加入目标双螺旋DNA后,单链探针DNA与目标DNA分子形成三螺旋DNA,探针DNA从氧化石墨烯表面脱附,标记在探针DNA上的荧光分子的荧光恢复。在最佳实验条件下,荧光恢复的强度与探针DNA的浓度在20.0～300.0 nmol/L具有良好的线性关系,检出限为16.9 nmol/L。该方法在DNA药物筛选及基因疾病的诊断方面具有一定的应用前景。     

基于水溶性共轭聚合物分子刷的高灵敏凝血酶生物传感器

以刷子状水溶性共轭聚芴（PFNI）为传感材料,以荧光素标记的核酸适体（FAM-apt15）为探针,设计了一种检测凝血酶的高灵敏度蛋白质传感器. PFNI的刷状结构带有大量正电荷,与负电荷的柔性单链核酸探针形成静电复合物,使能量供体（PFNI）与受体（FAM）之间的距离较近,发生高效荧光共振能量转移（Föster resonance energy transfer,FRET）. 当探针与靶凝血酶结合时,形成刚性且体积较大的G-四链体/凝血酶复合物,由于体积位阻和密集的刷子的阻碍作用,PFNI与FAM之间的距离被拉大,FRET效率显著降低. 对缓冲溶液中凝血酶检测的最低检测限可达0.05 nmol/L. 与基于线型共轭聚合物的蛋白质检测方法相比,灵敏度提高了至少一个数量级.     

基于CRISPR/Cas的生物传感平台在分子诊断中的应用

簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)不仅在基因工程领域炙手可热,而且正发展成为核酸精准检测领域的新利器.得益于Cas蛋白对核酸序列的特异性识别以及部分Cas蛋白的附属切割活性,Ⅱ类CRISPR/Cas系统在体外诊断及现场即时检测领域独具优势.该综述简要介绍了CRISPR/Cas系统...     

发夹型荧光分子探针用于DNA甲基化酶的活性分析及其在药物筛选中的应用

报道了一种基于发夹型荧光探针的甲基化酶活性的分析方法, 甲基化酶和相应的限制性内切酶的识别位点被设计在发夹型探针的茎部, 四甲基罗丹明(TAMRA)被连接在探针的5'端, 其荧光被连在3'端的熄灭基团4-(4'-二甲基对胺基偶氮苯)苯甲酸(DABCYL)所熄灭. 限制性内切酶可切割未发生甲基化修饰的探针, 导致探针的发夹结构遭到破坏, 引起TAMRA荧光信号的恢复. 根据荧光信号的恢复程度可实现对甲基化酶活性的分析. 在此基础上, 建立了一种简便、快速分析抗肿瘤药物对DNA甲基化酶活性的影响的方法, 为筛选针对基因甲基化异常引起的恶性肿瘤的治疗药物提供了一种新的思路和方法.     

基于聚间苯二胺为受体的UC-FRET传感器检测凝血酶

本文以上转换发光材料(UCPs)为供体,聚间苯二胺(PMPD)为受体,构建了基于荧光共振能量转移(FRET)的传感平台,并将其用于凝血酶的检测。一定浓度的PMPD加入到标记单链DNA的UCPs体系中,对上转换发光的猝灭效率可以达到70%。当加入浓度在0.2~5.0nmol/L范围内的目标物凝血酶时,其荧光恢复程度与浓度呈线性关系,检出限为0.18nmol/L。PMPD因其良好的水溶性、荧光猝灭能力及免标记的特点为基于FRET技术的生物样品检测提供了新的平台。     

分子信标探针荧光法测定慢性粒细胞性白血病相关基因

根据慢性粒细胞性白血病(CML)相关基因b3a2序列设计了一种带有荧光基团和淬灭基团的凸环结构探针(分子信标,MB),研究其与互补目标DNA杂交前后的荧光变化行为,建立了b3a2基因检测的新方法.在最适条件下,得到杂交后溶液荧光强度与本底荧光强度的比值(S/B)和目标DNA 的浓度呈线性关系,r=0.9973,线性范围4.0×10-9～3.2×10-8 mol/L.该方法为实际样品的检测奠定了基础.     

基于杂交链式反应和共价有机框架的新型荧光传感器用于ctDNA的高灵敏和选择性检测

共价有机框架是近年来发展起来的一种高度结晶的多孔聚合物,由有机单元连接形成。由于其优异的孔隙率,模块性,结晶性和生物相容性,在传感领域显示出良好的应用前景。本文开发了一种基于杂交链式反应 (HCR) 和共价有机框架的新型荧光传感平台,用于高灵敏的检测循环肿瘤DNA (ctDNA)。ctDNA可以作为HCR的激活剂,通过触发发夹1 (H1) 和发夹2 (H2) 的自主交叉打开,激活HCR形成延伸的有缺口的双链DNA,导致荧光信号的变化,从而实现ctDNA的定量检测。HCR产物和荧光信号分别采用琼脂糖凝胶电泳和荧光光谱进行表征。ctDNA浓度在0-10 nM范围内,ctDNA的浓度与荧光信号呈良好的线性关系,检测限为1.3 nM。该方法对ctDNA具有满意的选择性,并在人类血清样品中显示出良好的性能。该荧光传感平台为ctDNA的检测提供了新思路,在癌症早期诊断中显示出潜在的应用前景。