不同结构的DNA激活序列对Cas12a反式切割活性的影响

CRISPR－Cas12a系统的反式切割活性在其识别特定的DNA激活序列后被激活,这不仅能实现特定DNA靶标的直接定量分析,同时也为构建针对多种生物标志物的体外传感体系带来了新的思路。然而,已有文献中所采用的双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）激活序列结构多种多样,缺乏全面、系统的设计指导原则。针对该问题,该文系统研究了不同结构的DNA激活序列对LbaCas12a反式切割活性的影响。通过对比研究,得出以下结论：（1）前间区序列邻近基序（PAM）位点有助于LbaCas12a更高效地靶向结合dsDNA激活序列和ssDNA激活序列;（2）PAM近端区域缺少序列片段会降低Cas12a-crRNA定位激活序列的效率;（3）删除PAM远端序列片段有利于增强LbaCas12a的反式切割活性;（4）由于省略了dsDNA解链过程,ssDNA激活序列在激活LbaCas12a的反式切割活性方面普遍比dsDNA激活序列产生的效果更好。根据这些发现,该文提出了一种LbaCas12a所青睐的高效激活序列结构,其激活的LbaCas2a反式酶切活性较采用含PAM位点的标准dsDNA激活序列高出3.7倍。研究结果为构建基于CRISPR-Cas12a的高效体外生物传感系统提供了重要支撑。     

分析仪器标本实物学习平台构建及教学实践探索——以分光光度计为例

针对本科生在分析仪器学习中存在的困难,探索构建分析仪器实物学习平台,将抽象的仪器原理和功能学习实物化、具体化;以学习者为主体制作仪器标本和多媒体自学课件,激活了学生自身的学习、创新能力;经过4年的教学实践,说明新模式提高了学习效率和教学效果。     

NaYF_4：Yb,Er上转换荧光纳米粒子的表面修饰及其在免疫分析中的应用

稀土掺杂上转换荧光纳米材料因其近红外区激发,可见光区发射的特殊发光性能,在生物标记方面具有独特优势,可大幅度降低荧光背景.β-NaYF4：Yb,Er是目前已知的发光效率最高的上转换荧光纳米材料之一,已在生命分析及生物成像分析领域展现出了广阔的应用前景.然而,由于现有β-NaYF4：Yb,Er制备工艺多是在高温条件下于高沸点有机溶剂中反应制得,所得产品在水溶液中的分散性差,限制了其在生命分析中的广泛应用.本文采用聚丙烯酸（PAA）配体交换反应,对表面包覆油酸基团的疏水β-NaYF4：Yb,Er纳米粒子进行了有效的表面修饰.表面修饰后,上转换荧光纳米粒子表面的PAA具有众多游离羧基,使其在水溶液中具有良好的分散性.同时,由于羧基的存在,使得带有氨基的生物分子能够通过化学交联反应结合到纳米粒子表面.本文以PAA表面修饰后的β-NaYF4：Yb,Er纳米粒子为荧光探针,以磁珠作为免疫反应的载体,成功构建了一种新型免疫传感器,对模型靶标分子羊抗人IgG进行了灵敏检测.磁珠表面固定兔抗羊IgG,PAA修饰的β-NaYF4：Yb,Er纳米粒子表面连接人IgG,当样品中存在羊抗人IgG时,便会在磁珠表面形成（兔抗羊IgG-羊抗人IgG-上转换荧光纳米粒子标记的人IgG）三明治式免疫复合体,通过磁分离除去未反应的组分,在980nm激光激发下测定免疫复合体的上转换荧光强度,即可实现靶标分子的高灵敏分析,可检测到低至0.1ng/mL的羊抗人IgG.同时,以磁珠为载体的免疫复合体也可通过激光扫描共聚焦荧光显微镜进行荧光成像分析,背景荧光信号低,成像质量高.实验结果表明,PAA修饰的β-NaYF4：Yb,Er上转换荧光纳米粒子是一种理想的生物标记材料,有望在生物传感及生物成像分析领域获得广泛应用.     

双链特异性核酸酶介导的高灵敏度microRNA分析

基于氧化石墨烯(GO)对荧光标记单链DNA探针的荧光猝灭效应以及双链特异性核酸酶(DSN)选择性切割DNA/RNA杂合结构中DNA单链的特性,本文建立了一种新型恒温信号放大方法用于microRNA(miRNA)的高灵敏度检测.靶标miRNA首先与荧光DNA探针杂交,DSN能够特异性地将杂合双链中的DNA探针水解为碎片但不会降解miRNA,GO对酶切产生的寡核苷酸碎片吸附能力显著降低,使得荧光基团远离GO表面而不被猝灭.释放出的miRNA可再次发生与荧光DNA探针杂交、DSN酶切等反应,如此反复,可实现恒温条件下一个miRNA分子与多个探针杂交、酶切、释放荧光基团的循环过程,最终体系的荧光信号得到显著放大,通过记录体系的荧光信号即可实现对靶标miRNA的灵敏检测.