基于分子信标策略的CRISPR/Cas12a荧光传感器用于循环肿瘤DNA的放大检测

构建了一种以分子信标（Molecular beacon, MB）为信号探针的CRISPR/Cas12a生物传感器,用于循环肿瘤DNA(Circular tumor DNA, ctDNA)的快速放大检测。MB具有良好的稳定性,其颈部末端分别标记有荧光素（FAM）和四甲基罗丹明（TAMRA）两种荧光基团。ctDNA不存在时,CRISPR/Cas12a体系无活性,无法切割MB,因此MB两端的荧光基团由于形成发夹结构的颈部相互靠近而发生荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET）,显示出TAMRA的荧光。当ctDNA存在时,ctDNA特异性识别Cas12a/crRNA二元复合物并激活Cas12a的反式切割活性。由于单链DNA是Cas12a最敏感的底物,因此MB的环部单链首先被切割,继而引起颈部双链的解离而导致两种荧光团彼此远离,无法发生FRET,最终显示出FAM的荧光信号。对MB环部的碱基数目、MB浓度以及crRNA与Cas12a的浓度比例等实验条件进行了优化。在最优条件下,1.7～500 pmol/L范围内,ctDNA浓度与传感...     

基于CRISPR-Cas12a与G-四链体构建免标记电化学生物传感器检测microRNA

CRISPR-Cas12a是一种功能强大且可编程的分子诊断技术。本文基于CRISPR-Cas12a的附属切割活性与G-四链体/氯化血红素（Hemin）复合物,设计了一个免标记电化学生物传感器,实现对miRNA的强特异性检测。靶标miRNA-21与双链DNA探针上的Toehold区域结合并发生链置换反应,置换出双链DNA探针中较短的DNA。置换下来的DNA可以有效地激活CRISPR-Cas12a的附属切割活性。随后,具有附属切割活性的Cas12a切割电极表面上形成G-四链体/Hemin的DNA序列,导致电流信号减弱。在最优条件下,电流信号强度变化与10～100 pmol/L范围内的miRNA-21浓度呈良好的线性关系,检出限为4.2 pmol/L。该电化学生物传感器能够实现对单个碱基突变的miRNA-21或其它miRNA序列特异性识别,并可用于人血清样本（10%）中miRNA-21的检测。     

CRISPR-Cas12a信号放大策略与便携式血糖仪耦合定量检测黄曲霉毒素B1

建立了CRISPR-Cas12a与便携式血糖仪耦合定量检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的方法。体系中AFB1能够激活Cas12a的反式切割活性,激活后的Cas12a切割电极上蔗糖酶修饰的发夹探针,使得蔗糖酶游离到电极表面的溶液中。蔗糖酶催化蔗糖产生可以被血糖仪监测的响应信号,进而实现对AFB1的检测。在浓度0.001～0.1 ng/mL范围内,AFB1浓度与血糖信号呈良好的线性关系,线性方程为S=3.5+229.1c,检出限为0.3 pg/mL。该方法特异性强,适用于实际样品中AFB1的检测。     

基于纳米金胶标记DNA探针的电化学DNA传感器研究

以纳米金胶为标记物,将其标记于人工合成的5-端巯基修饰的寡聚核苷酸片段上,制成了具有电化学活性的金胶标记DNA电化学探针;在一定条件下,使其与固定在玻碳电极表面的靶序列进行杂交反应,利用ssDNA与其互补链杂交的高度序列选择性和极强的分子识别能力,以及纳米金胶的电化学活性,实现对特定序列DNA片段的电化学检测以及对DNA碱基突变的识别.     

荧光探针Ru(phen)2(dppx)2+测定H1N1禽流感病毒DNA

利用荧光探针Ru(phen)2dppx2+与ssDNA作用时不产生荧光或荧光很弱,而与dsDNA作用时荧光增强的机理,将H1N1禽流感病毒ssDNA与其完全互补ssDNA杂交形成dsDNA实现Ru(phen)2dppx2+对H1N1禽流感病毒DNA特定序列（5’-CTA CCA TGC GAA CAA TTC AAC CGA CAC TGT T-3’）的定量检测。在优化的实验条件下,测定H1N1禽流感病毒 DNA的线性范围为9.3×10-10～7.4×10-8 mol/L,线性关系：y = 3.3829x + 8.3948,R2 =0.9982,检出限为5.3×10-10 mol/L。该方法具有操作简单,检测快速,灵敏度高和选择好等优点。     

基于PAMAM/聚2,6-吡啶二甲酸膜DNA电化学生物传感器的制备及对禽病毒基因检测的研究

以铂电极上聚合的2,6-吡啶二甲酸(PDC)膜组装G5.0树状高分子(PAMAM)固定ssDNA探针, 制备了一种新型的DNA电化学生物传感器. 用[Fe(CN)6]3－/4－作氧化还原指示剂, 以电化学交流阻抗和循环伏安技术对探针ssDNA的固定和杂交进行了表征. 实验表明, 当ssDNA在复合膜上固定及与其互补序列杂交后, 电极表面的传递电阻(Ret)依次增大. 因此, 可以利用Ret的明显差异, 以此固定探针的修饰电极, 对互补序列DNA进行无标记交流阻抗检测. 基于该生物传感器结合交流阻抗技术对禽病毒基因进行检测, 在优化实验条件下, 靶基因ssDNA-2在2.0×10－11～1.0×10－8 mol•L－1线性范围内, 其浓度与电极表面的电子传递电阻(Ret)之间呈良好的线性关系, 检测限为3.6×10－12 mol•L－1. 表明该方法为病毒灵敏地检测提供了一个有益的传感平台.     

CRISPR/Cas9基因编辑非病毒递送系统

规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统的基因编辑技术为哺乳细胞基因组的精准修饰与编辑研究提供了高效、快捷的工具,但其化学生物学应用依然面临着CRISPR基因编辑工具Cas9蛋白和g RNA的细胞及活体递送等问题.近年来,研究人员通过开发多种非病毒递送载体,实现了编码CRISPR/Cas9基因编辑工具的DNA和信使RNA(mRNA)以及Cas9/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物的递送,并应用于靶基因的化学修饰与编辑调控.本文主要概述了近期CRISPR/Cas9基因编辑递送的研究进展,并对其化学生物学应用前景进行了展望.     

DNA步行者在检测传感中的应用

DNA步行者（DNA Walker）是一种基于化学能布朗运动的人工模拟机器,由构象迁移和链置换反应驱动,在纳米轨道上实现物质的检测运输。基于DNA Walker的生物传感器是一种集生物和纳米技术于一体的新型高效传感器,在食品安全检测、生物传感等领域有巨大的应用潜力。本文介绍了DNA Walker的发展现状,并通过讨论,系统概述了DNA Walker传感器的设计原理及其在检测传感中的应用。总结了DNA Walker传感器的性能优势和所面临的挑战,并对该技术的研究前景进行了展望。     

基于末端脱氧核糖核酸转移酶的纳米界面上DNA的生长策略及用于恩诺沙星的适配体传感器构建研究

在纳米金(Au nanoparticles,AuNPs)表面通过组装巯基DNA制得AuNPs-DNA生物探针后,末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl transferase,TdTase)催化探针DNA的3′-OH端,实现DNA的生长,并得到生长产物长单链DNA(Single-stranded DNA,ssDNA)。通过琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜成像(Atomic force microscope,AFM)对探针及ssDNA进行表征,结果表明TdTase能够实现纳米界面上DNA的高效生长,卷曲状态下链长可达850 nm。进一步将这种DNA的生长策略与适配体(Aptamer)技术相结合。首先在纳米金表面组装适配体片段1,在醛基化的磁珠颗粒表面组装适配体片段2,以此构建针对恩诺沙星的适配体生物传感器(Aptasensor)。该传感器对ENR在10～1.0×10~5 ng/mL具备良好的响应性能,检出限为1.0 ng/mL,能明显区分环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等对照组信号。研究表明,基于TdTase的适配体传感器操作便捷,具备良好的靶分子响应性能和特异性,可为食品安全检测等领域提供新的研究思路。     

基于上转换发光共振能量转移的CRISPR/Cas12a生物传感系统用于HPV16 DNA双信号检测

传统的纯核结构的上转换纳米材料用于生物传感时, 存在表面猝灭效应或者因发光共振能量转移(LRET)效率不高导致灵敏度低等缺点, 对目标物的灵敏检测有一定的局限性. 本文通过多步高温共沉淀, 介导壳层外延成长法, 合成了NaYF₄∶Yb³⁺,Er³⁺(C-UCNPs)核层发光和NaYF₄@NaYF₄∶Yb³⁺,Er³⁺@NaYF₄(CSS-UCNPs)内壳层发光能量限域型上转换纳米材料, 并表征了材料的晶型、 形貌、 表面配体、 元素组成和发光共振能量转移效率. 结果表明, 该材料具有表面猝灭效应低、 发光共振转移效率较高的优势, 随后将其与成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)12a-纳米金系统结合, 实现了人乳头瘤病毒DNA(HPV16 DNA)的比色定性和上转换发光定量分析, 检出限为69.8 pmol/L, 双信号检测有效提高了检测结果的准确性. 此外, 本方法不仅特异性强, 还能识别单碱基错配的HPV16 DNA, 提高了DNA片段的容错率.     

Application of multidimensional affinity high-performance liquid chromatography and electrospray ionization liquid chromatography-mass spectrometry to the characterization of glycosylation in single-chain plasminogen activator initial results

Preliminary results are presented using a combination of affinity chromatography, reversed-phase HPLC and electrospray ionization mass spectrometry to produced peptide maps for N-linked, O-linked and non-glycosylated peptides from an endoproteinase LysC digest of DSPA1, a recombinant DNA derived glycoprotein. Although the system was used to identify a number of major N-linked structures, notably complex biantennary structures attached to asparagine 362, no O-linked glycopeptides from the possible 4 attachment sites were identified. The system did, however, demonstrate the feasibility of the approach and the applicability of the instrumental system.     

Synthesis and Expression of a Gene From Kringle-2 Domain of Tissue Plasminogen Activator in E. coli

The DNA fragment corresponding to the tissue plasminogen activator (tPA) sequence 174-262 (Kringle-2 domain) has been synthesized by using the solid phase phosphotriester method. The Kringle-2 domain of human tPA was expressed in Escherichia colt by secretion into the periplasmic space using the Lpp-Lac promoter and PIN-Ⅲ OmpA2 signal sequence. About two thirds of the expression product was secreted into the periplasmic space , and purified with ammonium sulfate fractionation, affinity chro-matography on Lysine-Sepharose, and FPLC-Mono Q exchange chromatography. The amino acid composition observed from the Kringle-2 purified from E. coli is identical with that expected for the 174-262 fragment of human tPA. Radio binding assay shows that the recombinant Kringle-2 domain possesses the activity of fibrin binding.     

脂蛋白脂酶激活剂艾溴利平类似物的合成

合成了两个新型的艾溴利平类似物——N-2 -硝基-4-氯苯基-4-[(膦酸二乙酯基)甲基]苯甲酰肼(5,总收率28.1％)和N-2-四氮唑基-4-氯苯基-4-[(膦酸二乙酯基)甲基]苯甲酰胺(7,总收率30.5％).以对氯甲基苯甲酸为原料,经酯化、水解和酰氯反应制得中间体4-[(膦酸二乙酯基)甲基]苯甲酰氯(4);4与2-硝基-4-氯苯肼盐酸盐反应合成了5.4先与2-氨基-5-氯苯腈反应制得N-2-氰基-4-氯苯基-4-[(膦酸二乙酯基)甲基]苯甲酰胺(6);6再与叠氮化钠反应合成了7.其结构经1 H NMR和IR表征.     

Solid-phase Synthesis of Acyl-plasminogen-Streptokinase Activator Composite（APSAC） and Its Thrombolytic Properties

The dialysis method has been traditionally used for the conversion of native human plasminogen (Glu-Hpg) to lys-plasminogen(Lys-Hpg). Here is described a solid-phase synthesis method for the preparation of an acyl-plasminogen-streptokinase activator complex(APSAC) from Lys-Hpg, streptokinase (SK) and chemical modification agent(4-amidinophenyl-4‘-aminobenzoate hydrochloride) with the L-lysine-Sepharose 4B Column as the carrier. The new method significantly increases the product yield and purity over the liquidphase methods. The APSAC prepared with the new method exhibits a significant thrombolytic effect with a long half-life of about 8.8 h in rabbits.     

分子动力学研究亚铁血红素激活蛋白转录激活机理

以3种亚铁血红素激活蛋白(Heme activator protein, HAP)-DNA 复合物(野生型HAP1-wt, Ser63/Arg63突变HAP1-18 和 Ser63/Gly63突变HAP1-PC7)为对象对亚铁血红素激活蛋白的转录激活机理进行了分子动力学研究. 对3个复合物分子动力学轨迹的比较性分析显示, 涉及到上游活化序列(Upstream activation sequences, UAS)识别的蛋白质-DNA 相互作用分布与实验观测到的3种蛋白转录活性一致. 进一步对3个复合物进行柔性分析显示, 3个DNA分子具有相似的柔性, 而又有所不同, 特别在涉及UAS识别的N-端和Zn2Cys6结构域前部有明显的柔性差异. 蛋白质柔性的差别导致不同的蛋白质-DNA相互作用. 因此亚铁血红素激活蛋白的N-端和Zn2Cys6结构域前部的柔性大小能够调节亚铁血红素激活蛋白转录激活功能.     

重组人糖基化尿型纤溶酶原尿激活剂中糖链的组成研究

重组人糖基化尿型纤溶酶原激活剂(RHU-PA)是一种溶血栓药物。研究了使单糖从RHU-PA中定量释放的酸解条件和纯化单糖的方法。应用气相色谱技术测定了RHU-PA上的糖链由岩藻糖、甘露糖、半乳糖和N-乙酰氨基葡萄糖组成,相对摩尔比为1.0∶3.9∶1.1∶3.4。酸解法测得的总糖含量与酶解法测得的结果一致。     

分子动力学模拟研究活化剂对葡萄糖激酶活性的影响及活化机理

葡萄糖激酶(GK)催化葡萄糖转变为6-磷酸葡萄糖,是糖代谢的第一步;GK的活性改变对葡萄糖的代谢影响很大.通过分子动力学模拟研究了葡萄糖激酶活化剂(GKA)对GK活性的影响,探讨了GKA的活化机理.包结自由能分析表明,范德华作用是GK和GKA体系的主要驱动力;与此同时,葡萄糖使得GK和GKA的结合增强.构象分析结果表明,GKA能够在一段时间内限制GK的构象,但不能长久维持GK的活化构象不变,这和以往的实验结果相一致.相关理论分析结果不仅有利于从原子水平解释GKA的活化机理,也可为设计新的用于糖尿病治疗的GKA提供一定的理论参考.     

萃取动力学光度法测定活化剂铝——铝(Ⅲ)-过氧化氢-铜(Ⅱ)-邻氨基酚/氯仿体系

研究了在pH 5.5的弱酸性介质中, 利用Al(Ⅲ)对Cu(Ⅱ)催化H2O2氧化邻氨基酚显色的指示反应的活化作用.用萃取平衡控制反应时间、水相中邻氨基酚的浓度和反应进行的程度.通过在424 nm下测量有机相的吸光度,建立了萃取催化光度法测定活化剂铝的新方法.方法的线性范围为0.004～0.25 mg/L,检出限为1.6×10 -6 g/L.用于水样和茶叶中铝含量的测定,结果满意.     

基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析化学合成酵母转录活化因子

基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱是近年来发展很快的一种新颖的质谱分析仪，尤其适用于生物大分子的分子量测定，本文介绍它在确证化学合成酵母转录活化因子Ａｃ（Ｑ＾２３６，Ｑ＾２４２），ＧＣＮ４（２２６－２５２）－ＧＧＣ－ＮＨ２的一级结构中的重要作用。