CODING ASSIGNMENTS OF EACH mRNA SYNTHESIZED IN VITRO AND PROTEIN COMPONENTS OF CPV OF SILKWORM BOMBYX MORI

The coding propertics of each mRNA synthesized in vitro of CPV have been examined. The mRNAs were separated by polyacrylamide gel electrophoresis and isolated from the gel slices. The individual mRNA was then translated into the wheat germ cell-free protein synthesizing system. The products of translation were analyzed by the immuno-reaction with the ~(125)I-IgG of each of the five electrophoretic protein components of CPV. The coding assignments were deduced on the basis of the immuuo-reaction as follows: mRNA_1, mRNA_3 and mRNA_9 encode group P_1 of viral proteins, mRNA_2 and mRNA_6 encode group P_2 and P_3, respectively, mRNA_7 and mRNA_6 encode group P_4 while mRNA_9 encode group P_5.There axe more than 10 polypeptides in the CPV virion as demonstrated by two-dimensional electrophoresis.     

家蚕细胞质多角体病毒(CPV)双链RNA为模板的RNA多聚酶和转甲基酶的蛋白亚基组成

本文以家蚕CPV的基因与酶复合物为材料进一步研究了家蚕CPV-的RNA多聚酶和转甲基酶的蛋白亚基组成,一种方法是直接用~(125)Ⅰ-标记的基因与复合物中的蛋白质分析。其中含有三种不同分子量的蛋白质即结构蛋白P1(分子量33,000),P2(分子量67,000)和P4(分子量142,000),这三种结构蛋白在SDS-等电聚焦电泳中都表现了二种以上分子量相同而电荷不同的蛋白。第二种方法是分别应用CPV的5种结构蛋白的抗体抑制CPV RNA多聚酶和转甲基酶的能力进行判断,结果表明CPV RNA多聚酶合有结构蛋白P1(33,000),P2(67,000)和P4(142,000),而转甲基酶主要由结构蛋白P1组成。     

禽流感病毒H5N1病毒颗粒中鸡胚宿主蛋白的质谱分析

在A型流感病毒等许多包膜病毒的病毒颗粒中,除包含病毒基因组编码的结构蛋白外,还包含来源于宿主细胞的多种蛋白。然而,在鸡胚内增殖的病毒颗粒所包含的宿主蛋白的种类尚不清楚。本研究采用20%～60%(w/w)蔗糖密度梯度离心法分离纯化了繁殖于鸡胚的流感病毒,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)结合质谱法对纯化的流感病毒颗粒进行了全面的蛋白质组学分析。结果表明,在病毒颗粒中,除包含9种病毒编码蛋白外,还发现了12种来源于鸡胚的蛋白,如膜联蛋白A2、肽酰脯氨酰顺反异构酶B、过氧化物酶1、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶肌组织异构酶等,以及2种细胞骨架蛋白(微管蛋白b-3和肌动蛋白)。     

小麦丛矮病毒的L,NS和N蛋白在病毒RNA的体外转录过程中的作用

本文对小麦丛矮病毒核衣壳(WRSV-NP)进行分级解聚并通过甘油垫子超离心,可分别得到L蛋白,NS-N-RNA复合物,NS蛋白和N-RNA复合物等4个病毒组份。这些组份在单独测定时都不表现RNA聚合酶活力;在进行不同重组以后发现,只有当L,NS和N-RNA复合物同时共存时才能进行体外转录。实验还表明,这三种蛋白质与WRSV-RNA的结合力依次为N>>NS>L。根据结果,我们推测:L和NS蛋白可能共同构成RNA聚合酶复合物;而与病毒RNA紧密结合的N蛋白可能具有保持基因模板活力的功能。     

中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白预测与鉴定

摘要 本文采用RT-PCR方法和质谱分析对中蜂囊状幼虫病毒辽宁株（CSBV-LN）全基因组进行分子克隆、序列测定、分子生物学特性分析及其结构蛋白预测和鉴定。结果获得CSBV-LN全基因组序列长为8863个核苷酸,编码一个大的开放阅读框,其中包括178nt的5'非编码区的前导序列和142nt的3'非编码区,后面跟着一个poly(A)的尾巴。通过软件分析表明,CSBV-LN蛋白序列,类似于哺乳动物的小RNA病毒蛋白序列,预计存在VP1,VP2, VP3和VP4四个小的结构蛋白,系统分析进化分析表明CSBV,SBV和 DWV起源相同,推测CSBV有着类似DWV的结构蛋白序列5’-VP2 VP4 VP1 VP3-3。基于此,根据PAGE蛋白条带的大小,利用NetPicoRNA软件预测结构蛋白的裂解位点。在此基础上,对纯化后的CSBV进行SDS-PAGE,经SDS-PAGE分离到的4个蛋白进行质谱分析,结果鉴定出VP1、VP3和VP0三个蛋白。     

大豆(Glycine max)贮藏蛋白两种编码顺序的克隆与性质

本文证明大豆(Glycine max)贮藏蛋白的两种编码顺序已经克隆。并通过分子杂交和体外翻译研究了它们的性质。其中一顺序与两种分子量不同的mRNA杂交,杂交选择mRNA在体外翻译成60kd和42kd多肽,推测为7S贮藏蛋白的α和β亚基,另一顺序则与分子量为0.7×10~6dalton的mRNA杂交,杂交选择mRNA在体外翻译成57kd和49kd多肽。     

寨卡病毒抑制剂的虚拟筛选、设计、合成及生物活性研究

由甲基转移酶和RNA聚合酶组成的多功能蛋白(NS5)是寨卡病毒复制过程中起主要作用的蛋白组分,其甲基转移酶(5M5B)部分是病毒复制和宿主固有免疫应答的中心参与者,因此被作为潜在抗寨卡病毒药物开发的首选靶标蛋白.将5M5B作为受体,利用其已知的结合位点与200多万个化合物小分子进行虚拟筛选,得到抗寨卡病毒的先导化合物2a,并对该先导化合物进行结构优化、改造、活性预测、化学合成、药理活性研究.使用~1H NMR和~(13)C NMR对所有合成的化合物进行了表征,并进行了体外活性测试.结果表明化合物3a[IC_(50)=(7.69±0.36)μmol·L~(-1)]的体外活性优于广谱抗病毒药利巴韦林活性[IC_(50)=(8.15±0.42)μmol·L~(-1)],本研究的方法与结果对寨卡病毒抑制剂的结构设计研究具有重要的指导作用.     

n-C_3H_7I和i-C_3H_7I的激光裂解

Wilson等人曾研究过碘代烷在266nm的激光光解RI→R+I＊(~2P_(1/2))(1)RI→R+I(~2P_(3/2))(2)由于他们所用的光解产物谱仪不能改变产物的检测方向,因而对C_2H_5I,n-C_3H_7I和i-C_3H_7I的光解通道(1)和(2)在飞行时间(TOF)谱上的分离没有成功。我们用束源可转动的分子束激光裂解产物谱仪(飞行距离531mm)研究了CH_3I和C_2H_5I在248nm的激光裂解后,又分别对n-C_3H_7I和i-C_3H_7I进行研究,并实现了I＊(~2P_(1/2))和I(~2P_(3/2))光解通道在TOF谱上的分离,测得光解通道比见表1。     

干扰素的功能表达机理——2′-5′三腺苷酸在干扰素抗病毒作用中的重要意义

本工作证实,pppA2′p5′A_2′p5′A(2′-5′P_3A_3)具有广泛的抗病毒作用,它能抑制RNA病毒如Influenza H_3N_2/77,Influenza H_1N_1/77,ECHO_(11),rhino,Sendal,Sindbis及VSV等病毒,也能抑制DNA病毒(如herpes Ⅰ型)在人胚皮肤肌肉成纤维母细胞中的致病,因而对病毒感染细胞起一定的保护作用。此外1μM2′-5′P_3A_3对个别病毒的作用效果(与其他病毒相比)甚至比512单位/毫升的干扰素(IFN)还好,这说明2′-5′P_3A_3在干扰素的抗病毒作用中具有很重要的意义。对2′-5′P_3A_3与IFN的抗病毒作用进行比较之后,发现对于多数病毒,二者虽有差异,但有一定的平行关系,少数病毒则二者差别甚远,所有这些差异可能是由于病毒本身的作用所引起。     

重组HEV衣壳蛋白截短体的表达及鉴定

戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)感染引起的肠道病毒性传染病. HEV是一种无囊膜的单股正链RNA病毒, 其编码区由3个开放阅读框(ORF)组成, 属戊型肝炎病毒科. HEV衣壳蛋白由ORF2编码. 本研究根据编码HEV ORF2 aa382~aa674的核苷酸序列克隆了p293基因, 并将其克隆入原核表达载体pET28a, 利用大肠杆菌BL21(DE3)对HEV衣壳蛋白截短体(p293)进行了表达. SDS-PAGE和Western blot检测结果表明, 在优化的表达条件下(1 mmol/L IPTG, 250 r/min, 37℃, 5 h), 重组蛋白p293能够在大肠杆菌内有效表达, 目的蛋白约占总蛋白的66.15%. TEM检测结果显示, 原核表达的p293能够在体外形成约30~40 nm的病毒样颗粒. 免疫印迹和免疫荧光检测结果表明, p293与HEV标准阳性血清具有良好的反应原性和反应特异性. 实验结果表明, p293可应用于HEV宿主吸附和病毒装配研究, 为HEV的预防与诊断研究奠定了基础.     

CRISPR/Cas9基因编辑非病毒递送系统

规律间隔成簇短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统的基因编辑技术为哺乳细胞基因组的精准修饰与编辑研究提供了高效、快捷的工具,但其化学生物学应用依然面临着CRISPR基因编辑工具Cas9蛋白和g RNA的细胞及活体递送等问题.近年来,研究人员通过开发多种非病毒递送载体,实现了编码CRISPR/Cas9基因编辑工具的DNA和信使RNA(mRNA)以及Cas9/gRNA核糖核蛋白(RNP)复合物的递送,并应用于靶基因的化学修饰与编辑调控.本文主要概述了近期CRISPR/Cas9基因编辑递送的研究进展,并对其化学生物学应用前景进行了展望.     

小麦丛矮病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶

本文证明小麦丛矮病毒含有依赖于RNA的RNA聚合酶,酶活力与病毒的核衣壳(NP)有关。NP的体外转录需要四种三磷酸核苷酸和Mg~2+,一定的盐浓度以及某些还原剂的存在能增大酶活力。通过SDS解聚和超迷离心可以将NP分解为上清和沉淀两个部分,上清含有NP的三种结构蛋白,L,N和NS;沉淀主要为病毒RNA。上清蛋白与病毒RNA的重新组合能再现病毒的RNA聚合酶活力,并且当蛋白与RNA的配比为100:7.7(W/W)时,RNA聚合酶重组活力达到最高。     

绵羊进行性肺炎病毒的抗原成分分析与PCR检测

利用绵羊胎肺细胞进行绵羊进行性肺炎病毒(OPPV)的增殖,对其病毒的细胞病变(CPE)进行探讨。采用10％蔗糖垫子及20％—55％不连续蔗糖密度梯度离心方法纯化OPPV,并用SDS-PAGE和Western Blotting试验分析OPPV的结构蛋白与抗原成分。此外,还应用聚合酶链反应(PCR)检测病毒细胞培养物和感染绵羊体外周血单核细胞中的OPP前病毒cDNA。结果表明,OPPV在绵羊胎肺细胞上所致CPE较典型;纯化的病毒经电子显微镜观察,病毒粒子结构完整,且量大较纯;OPPV有18条多肽带,分子量在18kd—120kd之间,其中含有gp120,gp50及gp473种不同分子量的糖蛋白;OPPV接种绵羊体后p28抗体的出现时间及高峰期均早于p94抗体,且p28抗体的反应强度亦高于p94抗体。经PCR检测表明,OPP前病毒cDNA整合于绵羊胎肺细胞和绵羊体外周血单核细胞的最初时间分别为接毒后24h与第9天。     

免疫磁分离技术结合阻抗测量法快速检测禽流感病毒

采用免疫磁分离和阻抗测量技术联用的方法,实现了对禽流感H5亚型病毒的特异性快速检测。将偶联生物素的H5抗体固定于链霉亲和素修饰的纳米磁珠表面,制备成免疫磁珠,用于样品中禽流感H5N1病毒的分离和浓缩。使用金叉指阵列微电极测量样品阻抗,在特征频率(100 kHz)下,阻抗模值随样品中H5N1病毒浓度增加而增大。研究了抗体浓度、免疫反应时间和磁分离时间对阻抗信号的影响,结果表明,在优化的实验条件(抗体浓度0.25 g/L、免疫反应时间60 min、磁分离时间3 min)下,纯病毒样品和拭子样品中H5N1病毒浓度分别在2!1～24HA unit/50μL和20～24HA unit/50μL范围时,病毒浓度对数值与阻抗信号值呈线性相关关系,检出限分别为0.5 HA unit/50μL和2 HA unit/50μL。     

表达烟草花叶病毒外壳蛋白的转基因烟草及其对TMV的抗性

利用体外重组DNA技术构建携带烟草花叶病毒(TMV,国内流行的普通株)外壳蛋白基因(CP)的中间表达载体,通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒,重组TMV-CP基因被转移至烟草细胞,并获得大量再生的转基因烟草。工程烟草的基因组经Southern印迹法分析证明,CP基因在再生工程株染色体中有1—5个拷贝的插入。分子杂交分析确证TMV-CP基因在转基因株中获得正确表达,其mRNA和蛋白产物的丰度分别达0.005—0.01％及0.05—0.2％。攻毒实验表明90％以上的能表达TMV—CP基因的工程烟草能不同程度地抑制病毒的复制、扩散,并显著延缓,减轻系统病状的发生。有3株工程植株直至花期无病状表现,生长正常。这一抗性作用机制在于转化细胞中的外壳蛋白在病毒侵染早期有效地抑制了入侵病毒颗粒的脱壳,从而阻断病毒的复制。     

核酶的体外合成及其对烟草叶病毒RNA靶的作用

通过微机对烟草花叶病毒(TMV)RNA二级结构的分析并参照烟草环斑卫星病毒(sTobRV)的锤头型(hammer head)催化性RNA(即ribozyme或核酶)序列,我们在体外分别合成了以TMV移动蛋白(MP)基因区域正链和负链及正链3’末端序列为靶的锤头型核酶RZ1,RZ3和RZ2。体外结果表明,RZ1在50,37和30℃都能切割含有其靶序列的体外转录TMV RNA BT1(+)和BT2(+);与之相比,RZ3在50,37和30℃都只能部分切割靶RNA BT2(-)。至于RZ2,它对TMV正链3’末端内的靶序列的任何切割作用则未能观察到。我们在核酶RZ1的催化序列的茎环内或其3’末端引入了一个起稳定作用的序列CUUCGG以观察该序列对核酶的影响,实验表明这种修饰并不改变核酶的作用效率。     

马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。     

糖基化在新型冠状病毒侵染中的机制及药物研发中的应用

冠状病毒(Coronavirus, CoV)是一类具有包膜的正股单链RNA病毒,可感染人类和多种动物。2019年末,一种新的β-冠状病毒SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2)开始在人际间传播,该病毒引发的疾病“COVID-19”(Coronavirus disease 2019)对全球公共卫生构成严重威胁。糖基化是一种存在于蛋白质上的翻译后修饰,可影响蛋白质的折叠、稳定性及和受体之间的结合等,研究表明SARS-CoV-2包膜中的病毒嗜性决定因子-刺突蛋白(Spike,S)及宿主细胞上的主要受体血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)均为高度糖基化蛋白。为探明糖基化修饰在SARS-CoV-2病毒侵染及与宿主免疫应答中的作用,本文综述了该病毒的侵染机制,体外重组病毒S蛋白和宿主受体ACE2的糖基化类型及糖基化对病毒与宿主相互作用的影响,并提出基于糖基化的COVID-19诊断和药物研发新策略。     

绵马贯众抗禽流感病毒活性部位的高效液相色谱-质谱法分析

分别在ESI( )、ESI(-)和APCI( )3种电离检测模式下对绵马贯众抗禽流感病毒活性部位进行了液相色谱分离及离子阱质谱检测,共有21种组分能在2种或3种检测模式下被同时检测到.比较分析3种检测模式下得到的总离子流色谱图及各色谱峰的多级质谱图,并参考相关文献,推测活性部位中含有15种间苯三酚衍生物,是绵马贯众抗AIV活性部位的主要成分.     

血卟啉衍生物的色谱分离

本文拟定的纸色谱法是以苯-乙酸乙酯-甲醇-乙酸(9:2:1:1)作展开剂,将血卟啉衍生物(HPD)分离为五部份,分别测定各部份浸取液的荧光发射光谱,作为一种对血卟啉衍生物组份作对比鉴定的参考方法。采用Ward的高效液相色谱程序对比研究结果表明,国产与美国产HPD的组份近似,均以血卟啉为主要组份,而前者血卟啉的含量较高;二者还均含有羟乙基乙烯基衍生物和羟基乙酸酯,初步研究了血卟啉衍生物在甲醇-水溶剂系统中的高效液相色谱行为,进一步将血卟啉衍生物分离为九部份,有利于单一组份研究。