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外泌体是由各种类型细胞在正常或非正常生理情况下分泌释放至细胞外且携带多种生物活性分子的细胞外囊泡,在细胞间通讯和免疫应答等生物过程中发挥着重要作用。肝内胆管癌是一种胆道上皮恶性肿瘤,早期无明显临床症状且生存率较低,目前常用的诊断手段包括依赖于影像设备的诊断方式和灵敏度及特异性较低的诊断标志物等,这些手段的不足对发展新的特异性标志物提出了需求。该文对血清中的外泌体进行了分离和表征,并采用液相色谱-质谱技术针对健康组与肝内胆管癌患者组的血清样本和血清外泌体样本进行了无标记定量蛋白质组学分析,分别从两种类型样本中鉴定并筛选到271和430种可信蛋白质。基于血清样本和血清外泌体样本的可信蛋白质定量表达值进行多维统计分析都能将健康组与肝内胆管癌患者组良好地区分开。对血清样本中鉴定到的蛋白质进行差异蛋白质筛选,肝内胆管癌患者组相对于健康组有15个上调和8个下调蛋白质;对血清外泌体样本中鉴定到的蛋白质进行差异蛋白质筛选,肝内胆管癌患者组相对于健康组有33个上调和18个下调蛋白质;基于两种样本筛选到的差异蛋白质中仅有4个是重复的,且基于血清外泌体样本的51个差异蛋白质中有35个蛋白质属于外泌体蛋白质数据库。针对差异蛋白质进行生物学信息分析,与差异蛋白质相关的分子功能、生物过程和信号通路主要涉及天然免疫反应、炎症反应和凝血等过程。该研究为发现肝内胆管癌的潜在生物标志物和探究肝内胆管癌的发生、发展和转移等过程提供了参考和借鉴价值。此外,通过比较研究发现血清外泌体样本能够获得较多的差异蛋白质和生物学信息,证明了外泌体作为组学分析样本的价值和应用潜力。 相似文献
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外泌体是细胞分泌的微小具膜囊泡,作为重要媒介参与细胞间的信号传递,已在疾病的诊断和治疗中发挥独特作用。骨质疏松症是全身性骨代谢疾病,容易引起骨密度减少并导致骨折,在老年人群中发病率很高,目前急需发展特异性体液诊断技术。本论文采用超速离心的方法,对血清中的外泌体进行了分离富集和表征,并采用液相色谱-质谱进行了外泌体蛋白质组学分析,共鉴定到了179个外泌体蛋白质,主要参与防御响应和免疫应答等生物过程。针对来自正常对照组、骨量减少组和骨质疏松组的血清样本,分离富集其中的外泌体,通过免标记定量蛋白质组学分析,分别鉴定到188、224和185个蛋白质。定量分析显示17个蛋白质的表达量在骨质疏松组和骨量减少组有显著改变(p<0.05),包括Integrin β 3、Integrin α 2 β 1、Talin 1和Gelsolin等,说明人体骨质在衰变过程中发生了系统性变化,并体现在血清外泌体中。该研究可为骨质疏松研究提供潜在的分子标志物,有助于阐明其病变机制。 相似文献
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外泌体是一系列胞外囊泡,是生物标志物的来源,但目前尚无灵敏高效的唾液外泌体蛋白质分离方法。本研究采用质谱方法比较唾液外泌体试剂盒(Exo Quick,EQ)方法和超高速离心(Ultracentrifugation,UC)方法分离外泌体的效果以及尿素缓冲液、RIPA裂解液、SDS裂解液提取外泌体蛋白质的效果。Brodford法和BCA定量测定结果表明,EQ方法分离0.5 m L唾液外泌体得到的蛋白质含量高于UC方法分离2 m L唾液所得到的蛋白质。进一步的质谱分析表明,前者鉴定到的蛋白质数目亦多于后者;试剂盒分离唾液外泌体与尿素缓冲液提取外泌体蛋白质的方法联用效果最佳,鉴定到194种蛋白质。本方法重现性好、样品用量少、检测结果稳定,可为在唾液外泌体中筛选疾病的标志物提供方法学参考。 相似文献
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外泌体是细胞通过胞吐过程分泌的一类粒径为30~200 nm的囊泡,其组成包括脂质双分子层以及其内部包裹的细胞来源的蛋白质、核糖核苷酸(RNA)和脱氧核糖核苷酸(DNA)等生物分子。作为一种细胞间交流的重要方式,外泌体在一系列生理和病理过程中起着至关重要的作用。由于体液环境复杂,加之自身体积小、密度低,外泌体的富集与分离对于其后续分析和功能研究至关重要。该文介绍了外泌体的研究策略、表征手段及生物学功能和临床应用研究进展,特别对外泌体的提取方法进行了详细介绍,并加以系统评述。 相似文献
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外泌体是所有真核细胞分泌到细胞外的直径介于30~150 nm的一种膜性纳米囊泡,参与细胞间生物信号的传递。大量实验证据表明,外泌体参与多种生物功能并发挥重要作用,包括蛋白质、RNA和脂质等生物分子的转移及多种疾病生理和病理过程的调节,被认为是疾病诊断、治疗和预后的重要的生物标志物和药物载体,因此发展简单、高效、经济的外泌体分离与纯化技术将有助于疾病的早期诊断和精准治疗。目前,利用外泌体的物理化学和生物化学特性已开发出多种分离外泌体的技术,但仍缺乏标准化和规模化临床级外泌体的分离方法,从而限制了其临床应用。另外,对分离出的外泌体的特征、纯度和数量的鉴定是判断外泌体分离纯化方法优劣的重要指标。本文综述了外泌体分离与纯化技术以及鉴定方法的研究进展,主要讨论分离技术的机制、性能、挑战和前景以及外泌体的鉴定方法,以期为外泌体的分离纯化提供新的思路和解决策略。 相似文献
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蛋白质的N-糖基化是最重要的翻译后修饰之一,许多已知的血浆肿瘤诊断标志物及治疗靶标都是N-糖基化蛋白。针对血浆的糖蛋白质组研究有利于发现新的蛋白标志物。然而,血浆蛋白质浓度分布的动态范围非常宽,且同一位点上的糖链存在微观不均一性,影响了血浆中糖蛋白的鉴定效率。本文利用亲水材料ZIC-HILIC制备亲水富集柱分别对人血浆中的N-糖链和N-糖肽进行富集,并结合碱性反相色谱进行肽段的预分离和高准确度质谱分析,最终在健康人的血浆中鉴定到了299个糖基化蛋白、637个糖基化位点,并识别出31种不同的糖型。在这些鉴定到的糖基化位点中,新发现有107个N-糖基化位点(占总位点数的16.8%)。本方法操作简单,可以有效富集N-糖肽和N-糖,为在血浆中寻找糖蛋白和糖链生物标志物提供了可靠的手段。 相似文献
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外泌体作为一种细胞外囊泡,其内容物可以反映亲代细胞的重要信息,而自身也具有独特的结构,能够执行特征的生物学功能。基于外泌体的表面化学和生物学特征,制备了不同类型的金属/适配体(Apt)双功能复合磁性纳米材料,并将其应用于外泌体的富集纯化。将适配体和外泌体表面目标膜蛋白的特异性结合性能与以钛、锆为代表的金属氧化物和外泌体磷脂双层膜的特异性亲和作用结合,可极大地提高分离材料对外泌体的分离选择性和富集容量。分别以Fe3O4@Zr-MOFs、Fe3O4@Zr-Ti-MOFs和Fe3O4@TiO2等金属有机框架(MOFs)/金属氧化物磁性纳米材料为基底,制备对应的双功能MOFs/金属氧化物-适配体复合磁性纳米材料Fe3O4@Zr-MOFs-Apt、Fe3O4@Zr-Ti-MOFs-Apt和Fe3O4@TiO2-Apt,并进一步对不同材料的外泌体富集性能加以评价。以超速离心法提取的模型外泌体以及尿液为样品,对修饰相同质量适配体和不同含量金属氧化物的双功能材料的富集性能加以对比。将3种双功能磁性纳米材料应用于尿液外泌体的富集,得到的外泌体裂解后经质谱鉴定,分别得到233、343和832个外泌体蛋白。这一结果也表明双功能磁性纳米材料可以充分结合核酸适配体亲和的高选择性和金属氧化物的高富集容量优势,对于复杂生物样品中外泌体的快速、高效分离纯化具有潜在的应用价值,而针对材料制备和分离纯化方法的设计也为新型外泌体富集材料的设计提供了一条可行的新思路。 相似文献
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《化学进展》2016,(Z2)
在细胞通讯过程中,细胞分泌的大小在40~100 nm之间的外泌体具有负载"货物"并将其传递给靶细胞的能力。外泌体是细胞通讯重要的调节者,当疾病发生时,外泌体的组成会发生变化,在诊断和治疗方面均具有重要作用。外泌体作为药物的天然内源性载体具有独特优势,如其免疫原性低,在血液中的稳定性高,向细胞运输药物的效率高,和更强的增强渗透滞留效应(EPR)。目前,外泌体已经成功运载基因类药物、抗癌药物和抗炎症药物等其他类型药物。作为基因类药物载体,外泌体有助于同时提高转染效率和降低副作用。作为抗癌类和抗炎症类药物载体,外泌体可较好地保护药物免遭人体清除。本文按照外泌体负载"货物"的种类综述外泌体作为药物载体的最新进展,并简要讨论构建外泌体药物运输系统所需考虑的外泌体的来源、提纯方法、载药种类、载药方式以及载药系统的使用方式等关键因素对外泌体药物运输系统的影响,展望外泌体药物运输系统临床应用所面临的挑战和可能的解决途径。 相似文献
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自研究者证实外泌体承担了细胞外RNA等物质的运输功能以来, 关于外泌体来源与功能的研究一直备受关注. 近年来外泌体被发现具有作为疾病生物标志物的潜力, 使得拥有特定表面蛋白以及特定装载物的外泌体成为分析化学领域有价值的检测对象. 从化学本质角度来说, 外泌体的获取与分析需要依赖特异性的分子识别过程. 核酸适体作为分子识别单元, 因其特异性强、 亲和力高、 生物活性稳定、 易于合成和保存、 而且其序列和结构上具有可编程性, 易于设计和修饰, 已成功地用在外泌体相关的生物传感体系中. 本文从外泌体的化学组成及其具有生理、 病理意义的组分出发, 从外泌体通用生物标志物识别、癌细胞来源外泌体的检测及外泌体蛋白谱的分析这3个方面综述了以核酸适体作为分子识别单元在外泌体分析领域的代表性工作, 总结了现有的靶向外泌体的核酸适体序列信息以及应用场景, 阐述了利用化学合成与修饰以及DNA自组装等化学调控手段增强核酸适体分子识别性能的最新进展, 并从适用于外泌体分子识别的核酸适体的筛选以及化学修饰的角度, 对未来的研究方向进行了展望. 相似文献
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建立了分析肝癌患者血浆中低丰度差异蛋白的新的多维色谱串联质谱方法.以5例肝细胞癌(HCC)患者血浆为研究对象,选用免疫亲和色谱Agilent MARS Spin Cartridge去除血浆中6种主要高丰度蛋白;离线RP-HPLC预分级血浆低丰度蛋白并收集差异表达蛋白组;液相色谱-芯片(HPLC-CHIP,包含一支纳升级Zorbax 300SB-C18富集柱和一支纳升级Zorbax 300SB-C18分析柱)富集、分离差异表达蛋白组胰酶酶解肽混合物,线性离子阱质谱在线分析,以Spectrum Mill MS Proteomics Workbench自动分析MS和MS/MS数据后在UniProtKB/SWISS-PORT数据库中进行搜索,鉴定得到27种差异蛋白,其中23种蛋白与各种疾病或肿瘤相关,IMP3、ARNT2和GRIP1可能成为诊断HCC的潜在生物标志物. 相似文献
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外泌体是具有各种关键生物活性分子(如脂质、 蛋白质和核酸)的细胞外囊泡. 它们可以由所有类型的细胞分泌, 并分布在所有生物流体中, 如血液、 唾液、 汗水和尿液等. 更重要的是, 外泌体可以参与多种生理活动, 包括细胞间通讯、 哺乳动物的繁殖和免疫反应, 并在新陈代谢以及心血管疾病、 神经变性和癌症等疾病的病理进展中起重要作用, 这使其成为备受关注的天然非侵入性生物标记物, 并且被认为是可用于临床诊断和治疗的潜在工具。本文综述了用于检测外泌体的生物传感器的最新发展, 包括荧光、 电化学、 电化学发光、 表面增强拉曼光谱、 比色法和微流控技术等分析方法; 总结了在临床诊断和疾病治疗中外泌体的临床应用; 还讨论了外泌体检测所面临的挑战以及外泌体在临床诊断和疾病治疗等方面的应用潜力. 相似文献
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黄芪黄酮干预脾虚水湿不化大鼠血浆代谢组学研究 总被引:1,自引:0,他引:1
采用高效液相色谱结合飞行时间质谱检测正常大鼠、脾虚水湿不化证大鼠及黄芪黄酮组分干预后大鼠血浆内源性代谢物变化,获取大鼠血浆代谢图谱,研究黄芪黄酮组分干预脾虚水湿不化证的作用机制.采用高脂低蛋白饮食加负重游泳力竭建立脾虚水湿不化证大鼠模型,选择Halo C18色谱柱,流动相为0.05%甲酸-水与0.05%甲酸-乙腈,梯度洗脱,利用液相色谱-串联质谱分析测定大鼠血浆样品.利用主成分分析法对造模前后大鼠血浆样本进行代谢轮廓分析,结合变量投影重要性及显著性分析等筛选对分组贡献最大的差异标志物及相关通路,阐明药物的作用机制.结果表明, 黄芪黄酮组代谢轮廓异于模型组,而接近于正常组,共鉴定出了包含甘油磷脂类、鞘酯类、氨基酸类等在内的11种潜在生物标志物,其代谢通路包括三羧酸循环、甘油磷脂代谢、脂肪酸代谢及氨基酸代谢等,主要涉及体内能量代谢和脂肪代谢.黄芪黄酮干预脾虚水湿不化证大鼠后, 宏观指标(如体重、自主活动)和微观指标(如代谢标志物、血脂)均明显回调,表明黄芪黄酮可能主要通过调节能量代谢、脂肪代谢等途径而发挥健脾利水作用. 相似文献
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磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要形式之一,其异常往往会导致细胞内信号通路的紊乱和疾病的发生。固定化金属离子亲和色谱(IMAC)是磷酸化肽段的高效富集技术,在磷酸化蛋白质组研究方面应用广泛。该研究以金属钛离子(Ti4+)螯合IMAC材料(Ti4+-IMAC)为载体,进行磷酸化肽段富集。比较了10 μm Ti4+-IMAC通过振荡法和固相萃取法(SPE)富集磷酸肽的效果,发现振荡法可以富集到更多的磷酸肽;对比了两种尺寸(10 μm和30 μm)Ti4+-IMAC在磷酸化肽段富集中的差异,发现小尺寸材料富集效果更佳。进一步采用优化的策略比较了不同转移能力肺癌细胞的磷酸化蛋白质组,免标记定量蛋白质组学结果表明,优化的Ti4+-IMAC方法可以从正常的肺成纤维细胞MRC5、低转移肺癌细胞95C和高转移肺癌细胞95D中分别鉴定到510、863和1108种磷酸化蛋白质,其中317种为3组所共有。该研究共鉴定到1268种磷酸化蛋白质上的7560个磷酸化位点,其中1130个为差异磷酸化位点,文献报道显示部分异常表达的激酶与癌症转移密切相关。通过生信对比分析发现,异常表达的磷酸化蛋白质主要与细胞侵袭、迁移和死亡等细胞迁移方面的功能有关。通过优化磷酸化肽富集策略,初步阐明了磷酸化蛋白质网络的异常与肺癌转移之间的相关性,该方法有望用于肺癌进展相关的磷酸化位点、磷酸化蛋白质及其信号通路研究。 相似文献
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外泌体是一类由细胞分泌的含有脂质、蛋白、核酸等多种物质的纳米级囊泡,主要参与细胞间的物质交换及信息传导,与多种疾病的发生发展密切相关。对外泌体进行深入研究,理解其生物学功能,对疾病诊断与治疗具有重要意义。由于外泌体尺寸较小且密度和体液接近,想要对复杂生物样本中的外泌体进行分离与分析十分困难。传统的外泌体分离方法如超速离心、超滤等大都需要借助大型仪器设备,且耗时长、操作复杂。因此迫切需要开发高效、便捷的外泌体分离检测手段。微流控技术因其微型化、高通量、可集成等特点,为外泌体的分离分析提供了一个新的平台。该文主要对近年来微流控技术在外泌体分离分析相关领域的研究进展进行了综述。重点从外泌体物理特性和生化特性两个角度出发,介绍了微流控芯片技术用于外泌体分离领域的主要原理、策略和方法。此外,还介绍了微流控技术与荧光、电化学传感、表面等离子体共振等多模态检测方法结合,实现外泌体一体化分析的新进展。最后,该文分析了目前微流控技术用于外泌体分离检测存在的挑战,并对其发展趋势和前景进行了展望。随着微流控外泌体分离分析装置的不断微型化、集成化、自动化,微流控芯片技术将在外泌体分离、生化检测、机制研究等方面将发挥越来越重要的作用。 相似文献
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外泌体是一种由细胞分泌的膜性囊泡小体,直径通常为30~100 nm,密度为1.10~1.18 kg/L。外泌体广泛存在于各种体液中,可携带脂类、蛋白质、信使RNAs(mRNAs)、microRNAs(miRNAs)、非编码RNAs(ncRNAs)等多种重要的生物功能分子。许多证据表明,外泌体形成了一种特殊的细胞间信息传递系统,不仅影响细胞的生理状态,而且与多种疾病的发生与发展密切相关。该文简要综述了近年来在外泌体的分离和纯化方面取得的研究进展,并对蛋白质组学技术在外泌体分析中的应用进行了概述。此外,还对外泌体蛋白质组学研究的发展前景进行了展望。 相似文献
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结肠癌(CC)是全球常见恶性肿瘤之一,发病率呈逐年上升趋势,目前没有有效的标志物用于疾病早期诊断和干预跟踪。胆固醇及其氧化衍生物氧固醇在众多恶性肿瘤发生发展中发挥关键作用。该研究采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术,对CC临床血清样本中胆固醇及相关10种氧固醇代谢物进行了定性定量分析,并采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)进行多元统计分析,发现上述目标代谢物能够较好地区分CC组与健康对照组。为防止数据过拟合,该研究在PLS-DA模型各代谢物变量投影重要性(VIP)基础上,结合最优组分数及K-均值聚类结果,筛选得到3种代谢标志物。通过受试者操作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)分析,发现筛选得到的3种潜在标志物联合预测CC达到0.998,说明模型性能优良。GO(基因本体论)富集分析显示3种潜在标志物主要分布在内质网和包被囊泡上,参与胆固醇代谢、运输、低密度脂蛋白重塑等生物进程,发挥胆固醇运输活性和低密度脂蛋白颗粒受体结合的分子功能。KEGG(京都基因与基因组百科全书)通路分析显示3种潜在标志物富集于类固醇生物合成、PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)信号通路及ABC(ATP结合盒)转运等通路上。该研究为寻找CC标志物及进一步阐明胆固醇及氧固醇在CC发病过程中的作用奠定了一定的基础。 相似文献
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核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)从体外合成的寡核苷酸文库中筛选得到的短的寡核苷酸分子(ssDNA或RNA)。核酸适配体能够通过折叠成特定的空间结构与靶标分子进行特异性结合,与抗体相比,适配体具有高亲和力、易修饰、低成本、易于合成和低免疫原性等优势,可以针对细胞、蛋白质、组织、生长因子进行癌症生物标志物的研究。作为一种新的诊断方法,其在分子诊断领域具有广阔的应用前景。本文综述了近年来核酸适配体在肺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌诊断中的应用研究,阐明了核酸适配体作为分子探针从细胞的检测到血清的检测所扮演的作用。 相似文献
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基于液相色谱-串联质谱技术的磷酸化蛋白质组学分析 总被引:1,自引:0,他引:1
本文运用稳定同位素双甲基化标记技术、固定相金属离子螯合层析(IMAC)技术并结合液相色谱-串联质谱法研究了仙台病毒感染引起的宿主细胞磷酸化蛋白质组变化。实验发现定量的4 289个磷酸化肽段有~20%的蛋白质磷酸化位点发生了显著变化;通路富集分析表明哺乳动物雷帕毒素靶蛋白(mTOR)通路和剪接体(Spliceosome)通路可能参与宿主细胞对病毒的应答;通过对显著变化磷酸化肽段进行基序分析,发现了9个代表性的磷酸化修饰位点基序。本研究方法对于深入解析抗病毒天然免疫信号通路提供了新线索。 相似文献
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基于随机寡核苷酸与蛋白质之间的离子、亲和、疏水、氢键等相互作用力及多种空间结构作用,发展了一种基于随机寡核苷酸文库作为配基的新型血浆样品处理方法。采用寡核苷酸文库修饰的磁性颗粒(MNP@ssDNA)材料,在生理缓冲体系条件下捕获血浆样品中的蛋白质。比较了两种洗脱体系的洗脱效果,并利用nano-RPLC-ESIMS/MS对获得的蛋白质酶解液组分进行分析。结果表明,MNP@ssDNA材料处理后的血浆蛋白质鉴定数量提升了约29.5%,两种洗脱体系呈现良好的互补性(26.7%)。血浆中前10种高丰度蛋白质的谱图占有率从处理前的31.82%降低到21.31%(洗脱体系1)和26.20%(洗脱体系2)。在鉴定到的蛋白质中,丰度最低的蛋白质在血浆中的质量浓度约为0.29 ng/mL,该蛋白质仅在MNP@ssDNA材料处理后被鉴定到。结果证明MNP@ssDNA策略不仅能有效降低血浆中高丰度蛋白质的丰度,也为低丰度蛋白质的深度挖掘提供了新的思路。 相似文献