外泌体分离与纯化技术研究进展

外泌体是所有真核细胞分泌到细胞外的直径介于30～150 nm的一种膜性纳米囊泡,参与细胞间生物信号的传递。大量实验证据表明,外泌体参与多种生物功能并发挥重要作用,包括蛋白质、RNA和脂质等生物分子的转移及多种疾病生理和病理过程的调节,被认为是疾病诊断、治疗和预后的重要的生物标志物和药物载体,因此发展简单、高效、经济的外泌体分离与纯化技术将有助于疾病的早期诊断和精准治疗。目前,利用外泌体的物理化学和生物化学特性已开发出多种分离外泌体的技术,但仍缺乏标准化和规模化临床级外泌体的分离方法,从而限制了其临床应用。另外,对分离出的外泌体的特征、纯度和数量的鉴定是判断外泌体分离纯化方法优劣的重要指标。本文综述了外泌体分离与纯化技术以及鉴定方法的研究进展,主要讨论分离技术的机制、性能、挑战和前景以及外泌体的鉴定方法,以期为外泌体的分离纯化提供新的思路和解决策略。     

基于核酸适体的外泌体分子识别研究进展

自研究者证实外泌体承担了细胞外RNA等物质的运输功能以来, 关于外泌体来源与功能的研究一直备受关注. 近年来外泌体被发现具有作为疾病生物标志物的潜力, 使得拥有特定表面蛋白以及特定装载物的外泌体成为分析化学领域有价值的检测对象. 从化学本质角度来说, 外泌体的获取与分析需要依赖特异性的分子识别过程. 核酸适体作为分子识别单元, 因其特异性强、 亲和力高、 生物活性稳定、 易于合成和保存、 而且其序列和结构上具有可编程性, 易于设计和修饰, 已成功地用在外泌体相关的生物传感体系中. 本文从外泌体的化学组成及其具有生理、 病理意义的组分出发, 从外泌体通用生物标志物识别、癌细胞来源外泌体的检测及外泌体蛋白谱的分析这3个方面综述了以核酸适体作为分子识别单元在外泌体分析领域的代表性工作, 总结了现有的靶向外泌体的核酸适体序列信息以及应用场景, 阐述了利用化学合成与修饰以及DNA自组装等化学调控手段增强核酸适体分子识别性能的最新进展, 并从适用于外泌体分子识别的核酸适体的筛选以及化学修饰的角度, 对未来的研究方向进行了展望.     

微流控技术在外泌体分离分析中的研究进展

外泌体是一类由细胞分泌的含有脂质、蛋白、核酸等多种物质的纳米级囊泡,主要参与细胞间的物质交换及信息传导,与多种疾病的发生发展密切相关。对外泌体进行深入研究,理解其生物学功能,对疾病诊断与治疗具有重要意义。由于外泌体尺寸较小且密度和体液接近,想要对复杂生物样本中的外泌体进行分离与分析十分困难。传统的外泌体分离方法如超速离心、超滤等大都需要借助大型仪器设备,且耗时长、操作复杂。因此迫切需要开发高效、便捷的外泌体分离检测手段。微流控技术因其微型化、高通量、可集成等特点,为外泌体的分离分析提供了一个新的平台。该文主要对近年来微流控技术在外泌体分离分析相关领域的研究进展进行了综述。重点从外泌体物理特性和生化特性两个角度出发,介绍了微流控芯片技术用于外泌体分离领域的主要原理、策略和方法。此外,还介绍了微流控技术与荧光、电化学传感、表面等离子体共振等多模态检测方法结合,实现外泌体一体化分析的新进展。最后,该文分析了目前微流控技术用于外泌体分离检测存在的挑战,并对其发展趋势和前景进行了展望。随着微流控外泌体分离分析装置的不断微型化、集成化、自动化,微流控芯片技术将在外泌体分离、生化检测、机制研究等方面将发挥越来越重要的作用。     

纳升液相色谱-高分辨串联质谱研究不同分离方法对唾液外泌体蛋白质组的影响

外泌体是一系列胞外囊泡,是生物标志物的来源,但目前尚无灵敏高效的唾液外泌体蛋白质分离方法。本研究采用质谱方法比较唾液外泌体试剂盒(Exo Quick,EQ)方法和超高速离心(Ultracentrifugation,UC)方法分离外泌体的效果以及尿素缓冲液、RIPA裂解液、SDS裂解液提取外泌体蛋白质的效果。Brodford法和BCA定量测定结果表明,EQ方法分离0.5 m L唾液外泌体得到的蛋白质含量高于UC方法分离2 m L唾液所得到的蛋白质。进一步的质谱分析表明,前者鉴定到的蛋白质数目亦多于后者;试剂盒分离唾液外泌体与尿素缓冲液提取外泌体蛋白质的方法联用效果最佳,鉴定到194种蛋白质。本方法重现性好、样品用量少、检测结果稳定,可为在唾液外泌体中筛选疾病的标志物提供方法学参考。     

外泌体递药系统及其在肿瘤治疗中的应用

癌症是世界上第二大死亡原因,其每年的发病率都很高。尽管现有的治疗方法在过去十年中取得了重大进展。但是由于现有多数抗肿瘤药物具有非特异性细胞毒性、生物相容性差和生物利用度低等缺点,导致化疗等方法的治疗效果较差。外泌体是由多种细胞分泌的囊泡,具有磷脂双层结构和纳米颗粒大小。它具有良好的生物相容性、高稳定性和良好的靶向性。在癌症治疗中,外泌体作为一种潜在有效的药物递送系统已经引起越来越多的关注。本文综述了外泌体作为靶向肿瘤药物载体的设计策略,并试图为基于外泌体的纳米载体在各种肿瘤治疗中的应用提供新的见解。     

血清和血清外泌体的蛋白质组分析及其在肝内胆管癌中的应用

外泌体是由各种类型细胞在正常或非正常生理情况下分泌释放至细胞外且携带多种生物活性分子的细胞外囊泡,在细胞间通讯和免疫应答等生物过程中发挥着重要作用。肝内胆管癌是一种胆道上皮恶性肿瘤,早期无明显临床症状且生存率较低,目前常用的诊断手段包括依赖于影像设备的诊断方式和灵敏度及特异性较低的诊断标志物等,这些手段的不足对发展新的特异性标志物提出了需求。该文对血清中的外泌体进行了分离和表征,并采用液相色谱-质谱技术针对健康组与肝内胆管癌患者组的血清样本和血清外泌体样本进行了无标记定量蛋白质组学分析,分别从两种类型样本中鉴定并筛选到271和430种可信蛋白质。基于血清样本和血清外泌体样本的可信蛋白质定量表达值进行多维统计分析都能将健康组与肝内胆管癌患者组良好地区分开。对血清样本中鉴定到的蛋白质进行差异蛋白质筛选,肝内胆管癌患者组相对于健康组有15个上调和8个下调蛋白质;对血清外泌体样本中鉴定到的蛋白质进行差异蛋白质筛选,肝内胆管癌患者组相对于健康组有33个上调和18个下调蛋白质;基于两种样本筛选到的差异蛋白质中仅有4个是重复的,且基于血清外泌体样本的51个差异蛋白质中有35个蛋白质属于外泌体蛋白质数据库。针对差异蛋白质进行生物学信息分析,与差异蛋白质相关的分子功能、生物过程和信号通路主要涉及天然免疫反应、炎症反应和凝血等过程。该研究为发现肝内胆管癌的潜在生物标志物和探究肝内胆管癌的发生、发展和转移等过程提供了参考和借鉴价值。此外,通过比较研究发现血清外泌体样本能够获得较多的差异蛋白质和生物学信息,证明了外泌体作为组学分析样本的价值和应用潜力。     

外泌体生物分析及其临床应用研究进展

外泌体是具有各种关键生物活性分子(如脂质、 蛋白质和核酸)的细胞外囊泡. 它们可以由所有类型的细胞分泌, 并分布在所有生物流体中, 如血液、 唾液、 汗水和尿液等. 更重要的是, 外泌体可以参与多种生理活动, 包括细胞间通讯、 哺乳动物的繁殖和免疫反应, 并在新陈代谢以及心血管疾病、 神经变性和癌症等疾病的病理进展中起重要作用, 这使其成为备受关注的天然非侵入性生物标记物, 并且被认为是可用于临床诊断和治疗的潜在工具。本文综述了用于检测外泌体的生物传感器的最新发展, 包括荧光、 电化学、 电化学发光、 表面增强拉曼光谱、 比色法和微流控技术等分析方法; 总结了在临床诊断和疾病治疗中外泌体的临床应用; 还讨论了外泌体检测所面临的挑战以及外泌体在临床诊断和疾病治疗等方面的应用潜力.     

外泌体分离及其蛋白质组学分析的研究进展

外泌体是一种由细胞分泌的膜性囊泡小体,直径通常为30~100 nm,密度为1.10~1.18 kg/L。外泌体广泛存在于各种体液中,可携带脂类、蛋白质、信使RNAs（mRNAs）、microRNAs（miRNAs）、非编码RNAs（ncRNAs）等多种重要的生物功能分子。许多证据表明,外泌体形成了一种特殊的细胞间信息传递系统,不仅影响细胞的生理状态,而且与多种疾病的发生与发展密切相关。该文简要综述了近年来在外泌体的分离和纯化方面取得的研究进展,并对蛋白质组学技术在外泌体分析中的应用进行了概述。此外,还对外泌体蛋白质组学研究的发展前景进行了展望。     

基于串联质量标记的帕金森病血浆及血浆外泌体定量蛋白质组学分析

外泌体是一类可由各种细胞在生理和病理条件下释放的细胞外囊泡,其携带了多种生物活性分子,是疾病标志物的良好载体。目前,帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的诊断主要依靠临床表现,缺乏客观的疾病诊断标志物。因此,新型外周血特异性标志物的开发将有助于PD的早期筛查与诊疗。在本研究中,选取PD患者与正常对照人群的血浆及血浆外泌体作为研究对象,采用基于串联质量标记(tandem mass tag, TMT)的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对其进行定量蛋白质组学分析,在血浆和血浆外泌体样品中分别定量到724和611个蛋白质。采用基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)对定量到的所有蛋白质进行生物学信息分析,以了解蛋白质的基因本体论(gene ontology, GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集情况。根据细胞组分(cellular component, CC)分析,PD和正常对照组血浆样本中的差异表达蛋白质主要定位于细胞...     

血清外泌体的蛋白质组分析及其在骨质疏松中的应用

外泌体是细胞分泌的微小具膜囊泡，作为重要媒介参与细胞间的信号传递，已在疾病的诊断和治疗中发挥独特作用。骨质疏松症是全身性骨代谢疾病，容易引起骨密度减少并导致骨折，在老年人群中发病率很高，目前急需发展特异性体液诊断技术。本论文采用超速离心的方法，对血清中的外泌体进行了分离富集和表征，并采用液相色谱-质谱进行了外泌体蛋白质组学分析，共鉴定到了179个外泌体蛋白质，主要参与防御响应和免疫应答等生物过程。针对来自正常对照组、骨量减少组和骨质疏松组的血清样本，分离富集其中的外泌体，通过免标记定量蛋白质组学分析，分别鉴定到188、224和185个蛋白质。定量分析显示17个蛋白质的表达量在骨质疏松组和骨量减少组有显著改变（p<0.05），包括Integrin β 3、Integrin α 2 β 1、Talin 1和Gelsolin等，说明人体骨质在衰变过程中发生了系统性变化，并体现在血清外泌体中。该研究可为骨质疏松研究提供潜在的分子标志物，有助于阐明其病变机制。     

α-Amino acid derived enaminones and their application in the synthesis of N-protected methyl 5-substituted-4-hydroxypyrrole-3-carboxylates and other heterocycles

A new and simple synthesis of novel N-protected methyl 5-substituted-4-hydroxypyrrole-3-carboxylates, which exist in equilibrium with their 4-oxo tautomers, has been developed in two steps starting from N-protected α-amino acids. The key intermediates are enaminones, which can also be isolated, characterized, and used for the construction of other functionalized heterocycles, before they spontaneously decompose to pyrrole products. 4-Hydroxypyrroles are prone to partial aerial oxidation but can be efficiently alkylated or reduced to stable polysubstituted pyrrolidine derivatives.     

Specific intramolecular aromatic CH insertion of diazosulfonamides

The chemoselectivity in the intramolecular CH insertion of various diazosulfonamides has been experimentally studied. The results reveal that the aliphatic 1,4-, 1,5-, or 1,6-C(sp³)?H insertions of diazosulfonamides are not accessible, while the aromatic 1,5-C(sp²)?H insertion can be realized specifically by adjusting the diazo-adjacent group. In addition, the general chemoselectivities in the intramolecular CH insertions of diazosulfonyl compounds are summarized. Generally, diazosulfones undergo both aromatic 1,5-C(sp²)?H and aliphatic 1,5- and 1,6-C(sp³)?H insertions, while diazosulfonates undergo aliphatic 1,5- and 1,6-C(sp³)?H insertions. However, diazosulfonamides only undergo aromatic 1,5-C(sp²)?H insertion.     

N-Heterocyclic carbene-palladacyclic complexes: synthesis,characterization and their applications in the C-N coupling and α-arylation of ketones using aryl chlorides

N-Heterocyclic carbene-palladacyclic complexes 3 were successfully achieved in a one-pot procedure under mild conditions. The structure of 3a was unambiguously confirmed by X-ray single crystal diffraction and it was an active catalyst in the Buchwald-Hartwig amination and α-arylation of ketones even at very low catalyst loadings (0.01?mol%).     

Iodine-mediated oxidative Pictet-Spengler reaction using terminal alkyne as the 2-oxoaldehyde surrogate for the synthesis of 1-aroyl-β-carbolines and fused-nitrogen heterocycles

An efficient iodine-mediated oxidative Pictet-Spengler reaction in dimethyl sulphoxide (DMSO) using terminal alkynes as the 2-oxoaldehyde surrogate for the synthesis of aryl (9H-pyrido[3,4-b]indol-1-yl)methanones is described. The scope of the protocol includes the total synthesis of Fascaplysin, Eudistomins Y₁ and Y₂. The methodology is extended for preparing pyrrolo[1,2-a]-quinoxaline and indolo[1,5-a]quinoxaline derivatives. The utility of 1-aroyl-β-carbolines was demonstrated by performing palladium-catalyzed β-carboline directed ortho-C(sp2)-H functionalization of the phenyl ring with thiomethyl (SMe) group using DMSO as source and for accessing 4-aryl-canthin-6-ones.     

Facile synthesis of bicyclic 1-arylpyrazol-5-ones

In this Letter, we described a facile method for constructing fused bicyclic 1-arylpyrazol-5-one ring system. We employed various methylene-containing carboxylic acids as the substrates and proved that the pyrazolone ring closure requires activated methylene group in intermediate II. Accordingly, a series of structurally diversified, fused bicyclic 1-arylpyrazol-5-ones was prepared in moderate to high yields using the requisite substrates.     

Synthesis of pyrrolo[1,2-a]pyrazines and pyrazino[1,2-a]indoles by Curtius reaction in Morita-Baylis-Hillman derivatives

Synthesis of substituted pyrrolo[1,2-a]pyrazines and pyrazino[1,2-a]indoles from the Morita-Baylis-Hillman derivatives of acrylates via saponification followed by Curtius reaction is described.     

正丁胺对激光染料荧光谱影响的研究

用正丁胺作为碳源,采用射频辉光放电制备碳膜,选用激光染料R6G和聚乙二醇混合液作为蒸气源,采用单源热蒸发,在蒸发室与染料同时沉积得到混合膜,用拉曼光谱和红外光谱分析了碳膜的结构和键合方式,分析表明:碳膜中存在胺基团和氢原子.混合膜的荧光谱测量结果表明,认为正丁胺对染料荧光谱的影响是因为胺基和氢原子的存在.     

Cu0-catalysed 1,3-dipolar cycloadditions of α-amino acid derived N,N-cyclic azomethine imines to ynones

A series of 20 CuAIAC reactions between eight 4-acylamino substituted pyrazolidine-3-one-1-azomethine imines and four terminal ynones were performed using Cu⁰ as catalyst. The corresponding fluorescent cycloadducts were obtained in very high yields upon simple workup. Thus, Cu-metal turned out to be a better catalyst than Cu^I in terms of yield and ease of isolation. Availability of azomethine imines, mild reaction conditions, and simple workup enable a “click” access to libraries of densely substituted 2,3-dihydro-1H,5H-pyrazolo[1,2-a]pyrazol-1-ones. Reactivity of differently substituted dipoles was evaluated experimentally and by quantum chemical methods (DFT).     

Synthesis and antioxidative/anti-inflammatory activity of novel fullerene–polyamine conjugates

(E)-4-(Fullerenopyrrolidin-1-yl)-3-methylbut-2-enoic acid and its corresponding succinimidyl ester, readily obtained through Prato-type modification of C₆₀, were used for the selective N-acylation of polyamines. The thus obtained conjugates were evaluated for their antioxidative and anti-inflammatory activity and their cytotoxicity was determined. Members of this family of compounds showed interesting anti-lipid peroxidation, anti-lipoxygenase and anti-inflammatory activity and comparable cytocompatibility to spermidine.