鹿茸寡肽的制备及其促成骨细胞的增殖作用

从梅花鹿鹿茸中提取了天然鹿茸总多肽(VATP). 在进一步分离纯化的过程中, 筛选出具有促进成骨细胞增殖的高活性肽组分(VAP-B), 并通过制备型HPLC对其纯化, 得到了分子量分布约为200~600的小肽活性组分(VAP-B2). 细胞周期分析结果表明, 鹿茸肽VAP-B2组分促进了人成骨肉瘤细胞OS-732的周期转化, 使其细胞周期S期细胞指数明显增加, 即表现为S期DNA含量明显提高. 碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果表明, 随着鹿茸肽VAP-B2剂量的增加, ALP的活性明显增加. 这与成骨细胞增殖分化及成熟过程中, 细胞的周期性变化和骨形成标志物碱性磷酸酶水平的明显增高相符.     

酶解鹿茸肽的制备、纯化及抗氧化活性

利用一种工业用碱性蛋白酶对新鲜梅花鹿鹿茸进行水解制备生物活性肽。首先,考察了酶用量、底物浓度和反应时间对水解反应的影响,确定了最佳水解条件为酶浓度1：150,底物浓度1：13,水解时间60 min。其次,利用硫酸胺分级沉淀法制备了鹿茸多肽粗提液,同时采用缓冲液保护其活性,再经Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离纯化,得到了具有最强抗氧化活性的鹿茸肽组分（VAP-B）。最后,利用制备型高效液相色谱柱对VAP-B进一步纯化,得到了分子量在800以内的小肽活性组分（VAP-B1）,其蛋白含量为70.45%。在此基础上,对小肽活性组分VAP-B1进行了理化性质分析,检测其抗氧化活性,包括清除超氧阴离子,羟自由基以及抗脂质过氧化的能力和还原能力。实验结果表明,鹿茸肽VAP-B1浓度为20mg/ml时,对邻苯三酚自氧化的抑制率达到91.9%,有明显的清除超氧阴离子的作用;浓度为10mg/ml时,对羟基自由基的清除作用达到100%,且在一定的浓度范围内呈剂量依赖关系。此外,鹿茸肽VAP-B1具有一定的防止脂质过氧化和还原力作用。     

梅花鹿茸多肽的化学结构及生物活性

在马鹿茸活性多肽结构与功能研究基础上, 从新鲜梅花鹿茸中分离纯化了活性单体多肽, 确定了其化学结构, 并与马鹿茸多肽进行结构与活性比较. 利用离子交换层析、 凝胶过滤层析及反相高效液相色谱层析等生物化学技术, 从梅花鹿茸中分离得到1个新多肽, SDS-PAGE电泳显示为一条带, HPLC图谱为单一峰, MALDI-TOF MS给出该多肽的精确分子量为3263.4, 其等电点pI=8.15. 一级结构研究表明, 该多肽是由32个氨基酸残基组成的直链多肽, 不含半胱氨酸, 富含缬氨酸、 赖氨酸、 亮氨酸和甘氨酸, 氨基酸序列为VLSATDKTNVLAAWGKVGGNAPAFGAEALERM. 生物活性检测结果表明, 该多肽可促进原代培养的表皮细胞和软骨细胞增殖, 也能刺激NIH3T3成纤维细胞株的分裂. 梅花鹿茸多肽与马鹿茸多肽在结构上均为32个氨基酸残基组成的直链多肽, 但第5, 8, 11和30位氨基酸残基不同. 2种多肽结构上的变化并未影响其促细胞增殖生物活性.     

高效液相色谱分离纯化血管紧张素转换酶活性抑制肽

采用分步高效液相色谱法首次从菠菜核酮糖双磷酸羧化酶(英文缩写为Rubisco)的胃蛋白酶-胰酶复合酶水解产物中分离纯化了血管紧张素转换酶(ACE)活性抑制肽。水解产物经ODS柱分离得到活性组分,这些活性组分再依次经过氨基柱(PhA) 氰基柱(CN)和硝基苯乙基柱(NPE)4种色谱柱分离后,得到4种高度纯化的具有抑制ACE活性的多肽。经蛋白质序列自动分析仪测定,4种多肽的结构分别为MRWRD,MRW,IAYKPAG和LRIPVA。采用固相多肽合成法分别合成了这4种肽,并采用测定ACE活性抑制率的方法评价其     

类丹皮酚的结构修饰与在模拟体液中的稳定性考察和抗炎活性研究

丹皮酚、2-羟基-5-甲氧基-苯乙酮、3-羟基苯乙酮、2-羟基苯乙酮和2,4-二羟基苯乙酮先与1,4-二溴丁烷合成缩合物,再与酮洛芬合成系列目标化合物。用HPLC考察目标化合物在不同pH缓冲液中的降解情况,用二甲苯致小鼠耳肿胀模型对其进行抗炎活性筛选。合成了5个目标化合物,经MS和~1H-NMR确证其结构。HPLC证明其在体内稳定。小鼠实验表明,目标化合物具有较强的抗炎作用。目标化合物在胃肠道pH值中稳定,抗炎活性较强,值得进一步研究。     

蜂毒肽类似物的合成和生物活性研究

Melittin(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH₂)是蜂毒中含26个氨基酸残基的多肽,具有抗菌和溶血等生物活性,是典型的阳离子抗菌肽.本文设计合成了蜂毒肽C端15残基肽片段(GLPALISWIKRKRQQ-NH₂)及其类似物(15残基).研究了Melittin及这些合成肽的抗菌活性、溶血活性、疏水性及二级结构.结果表明,合成的类似物的溶血活性明显降低,抗菌活性基本保留,且与其疏水性相关.类似物中与碱性氨基酸簇(KRKR)距离较远的残基的疏水性对其抗菌活性有较大的贡献.多肽溶血与抗菌机理不同.类似物的抗菌活性和溶血活性与其二级结构(α-螺旋结构)没有明显的相关性.     

具有双活性序列的新型抗菌肽的设计及性质

设计合成了具有2个活性序列的线性和环状多肽及具有单个活性序列的短链多肽, 研究了它们的杀菌活性、 细胞毒性及溶血性. 结果表明, 线性肽和环状肽的杀菌活性高于短链肽. 利用计算模拟的方法计算了多肽与细菌细胞膜中一种重要的成分磷脂酰甘油(DMPG)的结合能. 结果表明, 多肽-DMPG的结合能与多肽的杀菌活性具有较高的相关性, 线性和环状多肽与DMPG的结合能大于短链肽. 线性和环状多肽均含有2个活性序列, 可提供多个荷正电氨基酸与荷负电的磷脂结合, 结合能较大, 杀菌活性较强. 采用模拟生物膜对其中几条多肽的作用机理进行了初步研究. 结果表明, 该类多肽有可能使正常哺乳动物细胞的细胞膜产生孔洞; 而对于细菌细胞膜, 多肽并未在膜上产生明显孔洞, 而是引起了细菌细胞膜的聚集.     

梅花鹿茸中活性多肽的纯化、测序及功能研究

利用凝胶过滤、离子交换层析及C18反相柱层析等方法, 从梅花鹿茸中分离得到了一个多肽CNT14, SDS-PAGE电泳显示其为一条带, HPLC图谱为单峰, 激光解析电离飞行时间质谱测定其分子量为1479.9028. 氨基酸组成分析结果表明, 此多肽主要含缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸及脯氨酸, 用电喷雾串联质谱法测序结果为E-P-T-V-L-D-E-V-C-L-A-H-G-P. 活性检测结果表明, 该多肽能够明显促进小鼠海马HT22细胞增殖. 同时, 采用固相合成法对该多肽进行了合成, 与所分离的天然多肽进行了结构与性质的比较.     

构象锁定HIV-1融合抑制剂的合成及抗HIV-1活性研究

西夫韦肽(SFT)是一种有效抗HIV-1(Human Immunodeficiency Virus-1)融合抑制剂,它比已上市融合抑制药物T20拥有更高的药效及药代稳定性,目前已完成了IIb临床实验.以西夫韦肽为模板,通过构象锁定策略将多肽中原有的盐桥替换为共价键合成了SFT订书肽SFT-1和SFT-2.产物结构经圆二光谱确认形成了α-螺旋.对所有合成多肽进行了抗HIV-1活性检测,结果表明SFT订书肽对7个HIV-1假病毒株抑制活性均高于SFT,其中SFT-1对B'亚型和B'C重组亚型病毒株抑制活性最高,SFT-2对B、CRF01_AE和CRF08_BC亚型病毒株抑制活性最高.     

单叶新月蕨稀土富集能力与结合多肽结构研究

以单叶新月蕨(Pronephrium simplex,金星蕨科新月蕨属)为研究对象,研究其在自然条件下对稀土元素的超富集能力.其叶片主动富集的稀土含量高达1249.37 μg·g-1,是母土的51.8倍、土壤中生物可利用态的650.7倍,且稀土元素分异现象与母土一致.在100μg·ml-1 Nd3+胁迫下,单叶新月蕨生长状况良好,且体内Nd含量提高,同时结合多肽的表达增加,证明单叶新月蕨具超富集稀土元素的特性;Nd结合多肽经酸处理脱掉Nd后,HPLC/ESI-IT-Ms的结果显示632Da的肽段是Nd在结合多肽中所处的区域.利用细胞分级、HPLC分离纯化、氨 基酸组成分析以及分子量和酶解肽段的MALDI-TOF-MS及ESI-IT-Ms测定富集过程中起着重要作用的稀土结合多肽,结果显示,稀土结合多肽的分子量为(5.07±0.02)KDa,其中含有-E-T-M-E-,-P-N-L-L-G-E-,-F-V-I-Y-E-和-F-V-I-A-的肽段.     

7-取代-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5(4H)-酮衍生物的合成及抗炎活性的研究

本文设计合成一系列7-取代-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5(4H)-酮(1a-p)类衍生物,并用小鼠耳肿胀法测定其抗炎活性。其中,在100 mg·kg~(-1)剂量下,三个化合物的抗炎活性优于阳性对照药吲哚美辛,而化合物7-(4-甲氧基苯基)-[1,2,4]三唑[1,5-a]嘧啶-5(4H)-酮(1k)表现出最强的抗炎活性,其耳肿胀抑制率为70.71%,具有进一步研究的价值。     

一种敬钊毒素蛋白的高效表达及分离纯化方法

本发明属于生物技术领域,公开了一种敬钊缨毛蛛粗毒中活性多肽JZTX58的高效表达系统与分离纯化方法。本发明通过基因工程技术,采用表达质粒p VT102 U/α和酿酒酵母S78菌株构成的真核表达系统,经过分离纯化、质谱分析鉴定成功表达得到敬钊毒素58(JZTX58)蛋白质,解决了直接从敬钊缨毛蛛粗毒中分离纯化而很难得到足量毒素来进行功能研究的难题,为进一步研究JZTX58的抗疟原虫活性奠定了重要的基础。     

血管紧张素转化酶活性抑制剂──丝素肽的分离、纯化和结构鉴定

 可溶性丝素粉末经碱性蛋白酶Alcalase水解后 ,其酶解产物对血管紧张素转化酶 (ACE)的活性有很强的抑制作用。采用凝胶过滤色谱SephadexG 15和反相高效液相色谱 (RP HPLC)对水解度为 2 0 %的酶解产物进行分离纯化 ,利用质谱鉴定其中一种ACE抑制剂是肽 ,其结构为Gly Tyr。     

同位素稀释质谱法测定多肽含量

利用Leu-Phe作为模型肽,建立了水解后同位素稀释质谱测定多肽含量的方法。在实验中优化了酸水解的时间,采用高效液相色谱法和质谱法证明模型肽已完全水解。水解后的氨基酸经过HPLC分离,质谱检测采用选择离子监测模式,分别检测苯丙氨酸(m/z=166)和标记苯丙氨酸(m/z=174)的离子。根据苯丙氨酸的含量计算模型肽的含量,并评定了测定结果的不确定度。     

傅立叶变换离子回旋共振质谱分析与鉴定骨桥蛋白的多肽片段

采用高效液相色谱(HPLC)SCX及C4色谱柱从人乳样品的乳清部分分离与纯化出骨桥蛋白(Osteopontin, OPN),在一定条件下将其用胰蛋白酶酶解后,利用高分辨傅立叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS),结合微喷雾(Nano-spray)技术,并借助Mascot软件数据库,获得了OPN相关多肽片段GDSVVYGLR和QNLLAPQTLPSK的质谱结构信息,分析了其裂解机理.研究表明,利用FT-ICR-MS并结合HPLC等化学方法,可以高效、快速地分离与纯化人乳样品中的OPN,借助Mascot软件数据库进行质谱分析,能够简洁、准确地鉴定相关多肽片段的结构信息,为OPN多肽片段不同翻译后修饰位点的确定与其生物学活性关系的研究提供了理论依据.     

基于反相液相色谱-串联质谱的鹿茸模拟胃肠道消化的肽谱及生物活性研究

利用反相液相色谱-串联质谱(Reversed phase liquid chromatography-tandem mass spectrometry,RPLCMS/MS)对鹿茸蛋白经过模拟消化的肽谱进行分析,同时考察了消化产物的体外活性。从鹿茸水提物(Antler aqueous extract,AAE)、鹿茸水提物消化产物(Aqueous extract digest,AED)和鹿茸的粉末消化产物(Powder digest,PD)中分别鉴定到23、417和389条肽段,其中源于胶原蛋白的肽分别有15、146和75条。以血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)、二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV,DPP-IV)、脯氨酰内切酶(Prolyl endopeptidase,PEP)抑制活性和抗氧化活性为指标考察AAE、AED和PD的体外生物活性,发现其活性强弱关系为AAEAEDPD。结果表明,经过模拟消化后,AED释放出更丰富的胶原蛋白肽,而PD具有更好的生物活性,说明食用鹿茸粉末和鹿茸水提物互为补充,各具优势。     

拟热带灵芝中杂萜类化学成分及其蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制活性

利用硅胶柱层析和半制备高效液相色谱(HPLC)等色谱分离技术对拟热带灵芝的化学成分进行分离纯化,从中分离得到了3个新的酚酸杂萜类化合物(ganoduriporols C～E).运用NMR和HRESIMS等多种波谱技术鉴定了它们的结构.对所分离的化合物进行体外PTP1B抑制活性测试,结果显示所得化合物具有明显的蛋白酪氨酸磷酸酶1B (PTP1B)抑制活性,其IC50值分别为19.1, 17.8和29.6μmol·L~(-1).     

凤眼莲重金属螯合肽的分离纯化及快速鉴定

本文以凤眼莲为模式植物,研究植物重金属螯合肽的分离纯化及其快速鉴定。凤眼莲放养在含2μg/ml Cd~(2+)的水中诱导13天。组织抽提液在低盐浓度下(0.01mol/L PBS)经Sephadex G-50柱层析,得到一个含Cd的巯基峰,凝胶过滤HPLC表观分子量为10000。将此巯基峰用过甲酸氧化,凝胶过滤HPLC表观分子量降至1300以下,经反相HPLC分析只有一个肽峰。G-50 Cd-巯基峰与反相HPLC肽峰的氨基酸组成相同,均为(Glu/Gln):Cys:Gly=2:2:1。依据重金属螯合肽的通式(γ-Glu-Cys)_n-Gly,可知n=2。过甲酸氧化后,反相HPLC和氨基酸组成偶联分析是鉴定是否为重金属结合肽以及其n值的快速有效的方法。     

反相液相色谱对多肽的分离、纯化与制备

用反相高效液相色谱（RPLC）对两种化学合成多肽－－32肽和21肽进行了分离、纯化和制备。在用分析型RPLC色谱柱对多肽样品的制备过程中，对其进样量和洗脱梯度进行了选择。每次进样量为5mg，在最优化色谱条件下，用RPLC一步就可对21肽进行分离纯化，其纯度达到98.6%。而32肽由于样品组分更加复杂，RPLC一步纯化后其纯度仅有80％。通过对色谱分离条件的再次优化，对32肽进行二次分离纯化，纯度达杂，RPLC一步纯化后其纯度仅有80％。通过对色谱分离条件的再次优化，对32肽进行二次分离纯化，纯度达到96.4%。在其最优化条件下，通过多次样品收集和冷冻干燥，分别制备了高纯度的21肽和32肽各100mg。     

反相高效液相色谱法分离制备蜂毒肽类似物

应用高效制备液相色谱法，对5种合成的蜂毒肽类似物分离制备。当用极性较强的洗脱液做流动相时，主峰的保留时间短，且主峰和前后的杂质峰不能很好的分开；随着洗脱液极性减弱至某一值时，主峰和杂质峰的保留时间均向后延长，且时间间隔加大，可以成功地对多肽样品进行分离制备。有多肽分子中各氨基酸保留常数加和值的方法可以预测不同多肽的保留时间，为选择分离纯化多肽所需的流动相提供了参考作用。经半制备分离纯化后的产物用分析型RP－HPLC测定达到了很高的纯度，氨基酸分析结果表明得到了所需的肽段，可以用于下一步的研究工作。