液相色谱-串联质谱分析组织中基因组脱氧核糖核酸羟甲基胞嘧啶水平

5-羟甲基胞嘧啶通过阻止脱氧核糖核酸(DNA)甲基化转移酶1(DMNT1)甲基化胞嘧啶来影响DNA甲基化的程度。本文建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定组织中全基因组5-羟甲基胞嘧啶水平的方法。采用苯酚-氯仿提取组织DNA,提取的DNA用88%甲酸在140 ℃下裂解,DNA裂解液加入同位素胞嘧啶作内标,经N2吹干后,加乙腈-水(9:1, v/v)溶解,用LC-MS/MS检测5-羟甲基胞嘧啶的含量,并计算全基因组中5-羟甲基胞嘧啶的水平。结果表明,5-羟甲基胞嘧啶的线性范围为0.1～30 ng/mL,相关系数为0.9969,检出限(信噪比为3计)和定量限(信噪比为10计)分别为0.057 ng/mL和0.090 ng/mL;日内相对标准偏差和日间相对标准偏差分别为5.13%和6.24%;加标回收率为90.24%～97.53%。用该方法检测了大鼠大脑组织DNA羟甲基化水平,平均结果为0.66%。该方法简便,重现性好,灵敏度较高,能满足全基因组5-羟甲基胞嘧啶定量检测的要求。     

液相色谱-串联质谱法同时测定生物组织全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平

测定全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平对于研究环境污染物暴露的影响及致病机理具有重要的作用。本文建立了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）同时测定动物组织中全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平的方法。从动物组织样品中提取DNA,并将其酶解成单核苷,利用液相色谱-串联质谱法测定5-甲基胞嘧啶核苷、5-羟甲基胞嘧啶核苷和鸟嘌呤核苷的含量,计算全基因组DNA甲基化率和羟甲基化率。利用该方法研究了砷暴露对大鼠肝脏和小脑全基因组DNA甲基化和羟甲基化水平的影响,得到了砷影响DNA甲基化及羟甲基化的初步数据。该方法具有良好的重现性、灵敏度和稳定性,可以同时检测差异较大的DNA甲基化和羟甲基化水平。为同时研究DNA甲基化和羟甲基化水平提供了有力的支持。     

基于高效液相色谱的喹啉类药物对刺参DNA甲基化水平的影响研究

建立了高效液相色谱/紫外法测定刺参组织全基因组DNA甲基化水平的方法,并运用此方法对喹噁啉药物处理过的刺参样品DNA甲基化水平进行分析。色谱条件为:色谱柱为ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250mm;5μm);柱温为30℃;检测波长为280 nm;进样量20μL;流动相为甲醇-7 mmol/L乙酸铵(7∶93),流速为1.0 mL/min。5-甲基脱氧胞苷和脱氧胞苷的质量浓度在0.05~1.0 mg/L范围内时,线性关系良好,相关系数(r)均为0.999 9。5-甲基脱氧胞苷和脱氧胞苷的检出限均为0.05 mg/L,在加标浓度为0.05,0.25,1.0 mg/L时,回收率为90.4%~100.6%,批内、批间相对标准偏差均小于4%。采用CTAB法提取刺参组织DNA,酶解后进行HPLC测定,结果表明:喹噁啉药物处理过的组织样品DNA甲基化水平低于对照组,该类药物通过改变DNA甲基化水平而影响基因的正常表达,可能是其产生遗传毒性的一种机制,建立的方法可以很好地用于全基因组DNA总甲基化水平的检测。     

基于高效液相色谱的喹噁啉类药物对刺参DNA甲基化水平的影响研究

建立了高效液相色谱/紫外法测定刺参组织全基因组DNA甲基化水平的方法,并运用此方法对喹噁啉药物处理过的刺参样品DNA甲基化水平进行分析。色谱条件为:色谱柱为ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250mm;5μm);柱温为30℃;检测波长为280 nm;进样量20μL;流动相为甲醇-7 mmol/L乙酸铵(7∶93),流速为1.0 mL/min。5-甲基脱氧胞苷和脱氧胞苷的质量浓度在0.05~1.0 mg/L范围内时,线性关系良好,相关系数(r)均为0.999 9。5-甲基脱氧胞苷和脱氧胞苷的检出限均为0.05 mg/L,在加标浓度为0.05,0.25,1.0 mg/L时,回收率为90.4%~100.6%,批内、批间相对标准偏差均小于4%。采用CTAB法提取刺参组织DNA,酶解后进行HPLC测定,结果表明:喹噁啉药物处理过的组织样品DNA甲基化水平低于对照组,该类药物通过改变DNA甲基化水平而影响基因的正常表达,可能是其产生遗传毒性的一种机制,建立的方法可以很好地用于全基因组DNA总甲基化水平的检测。     

人体结肠癌组织样品中基因组DNA甲基化水平的HPLC—ESI MS／MS检测

利用多重监测反应模式(MRM),通过对液相色谱及质谱条件的优化,建立了人体结肠癌组织样品中基因组DNA甲基化的高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESI MS/MS)检测方法,对结肠癌组织及癌旁组织中基因组DNA甲基化进行了检测.结果表明,5-甲基脱氧胞苷(5mdC)的检出限是1 pg,线性范围为0.037 5～0.5 mg/L,工作曲线相关系数大于0.999 0,该方法的相对标准偏差为2.32%～9.21%.结肠癌病人样品检测结果表明,结肠癌组织基因组DNA甲基化水平低于相应的癌旁组织(P<0.05).     

在线衍生-高效液相色谱法同时测定血浆中的色氨酸及其代谢物

建立了醋酸锌在线衍生高效液相色谱法同时测定血浆中色氨酸(Trp)、犬尿氨酸(Kyn)、5-羟吲哚乙酸(5-Hiaa)和犬尿喹啉酸(Kyna)的方法。以3-硝基酪氨酸为内标(IS),采用Hypersil C-18柱(250 mm×4.0 mm, 5 μ m),以250 mmol/L醋酸锌溶液(pH 5.5)-乙腈(95:5, v/v)为流动相,流速为0.8 mL/min,柱温30℃。荧光检测波长设定:5-Hiaa为278 nm(λ_ex)/343 nm(λ_em), Kyna为244 nm(λ_ex)/400 nm(λ_em);紫外检测波长设定:Kyn和IS为360 nm, Trp为302 nm。4种物质的回收率在91.62%~114.17%之间;线性范围分别为2.50~320.00 μ mol/L(Trp), 0.32~15.36 μ mol/L(Kyn), 3.27~104.60 nmol/L(5-Hiaa), 14.00~464.80 nmol/L(Kyna);检出限分别为0.078 μ mol/L(Trp), 0.056 μ mol/L(Kyn), 0.690 nmol/L(5-Hiaa), 1.290 nmol/L(Kyna)。利用该方法对30例正常孕妇和28例女性健康志愿者的血浆进行测定,结果表明两组间Trp, Kyn和Kyna含量有显著性差异。该方法操作简便,重复性好,灵敏度高,适合于临床检测。     

白菜DNA甲基化水平的反相离子对高效液相色谱法研究

建立了反相离子对液相色谱测定白菜的DNA甲基化水平的方法。采用的色谱柱为HypersilBDSC18柱(200mm×4.0mm,5μm),以pH4.0的甲醇-5mmol·L-1庚烷磺酸钠-三乙胺(10:90:0.2,体积比)的混合液为流动相,UV检测器波长为273nm。通过测定DNA水样所产生的胞嘧啶和甲基胞嘧啶的含量,即可得知DNA甲基化程度。胞嘧啶和甲基胞嘧啶回收率分别为99.6%及103.3%,RSD为3.7%(日内)及5.2%(日间)。     

液相色谱-串联质谱法测定生物样本全基因组DNA甲基化

建立了基于液相色谱-电喷雾串联质谱的分析方法,对生物样本中全基因组DNA甲基化水平进行定量测定.首先将DNA从生物样本中提取出来,将DNA片段酶解为单核苷,利用液相色谱-串联质谱测定胞嘧啶核苷和5-甲基胞嘧啶核苷的含量,从而计算出其全基因组DNA甲基化率.利用该法研究了暴露于全氟辛烷磺酸的L-02细胞、10例原发性肝癌病例血浆样本和10例对照血浆样本的全基因组DNA甲基化水平,得出了它们的总甲基化率变化的初步结果.本方法操作简单,具有很高的灵敏度和稳定性,为研究生物样本,尤其是临床上易得但DNA含量极低的血浆样本的总甲基化水平提供了思路.     

高效液相色谱-程序波长紫外检测法同时测定血浆中的色氨酸及其代谢物

建立了一种高效液相色谱-程序波长紫外检测法同时测定血浆中色氨酸(Trp)及其主要代谢产物犬尿氨酸(Kyn)和5-羟色胺(5-HT)。以茶碱为内标(IS),采用BDS-Hypersil-C8柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)分离。流动相为10 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH 4.5)-乙腈(94:6, v/v),流速为0.6 mL/min;柱温为25 ℃;紫外检测波长设定: Kyn和IS为360 nm, 5-HT为220 nm, Trp为302 nm。3种物质的平均回收率为87%～113%;线性范围分别为3.97～400 μmol/L(Trp), 0.421～20.2 μmol/L(Kyn), 4.36～980 nmol/L(5-HT);检出限分别为0.134 μmol/L(Trp), 0.0160 μmol/L(Kyn), 2.03 nmol/L(5-HT)。利用该方法对15例抑郁症患者和15例健康志愿者的血浆进行测定,结果表明两组间Trp的代谢存在显著的差异。     

以离子液体作流动相添加剂的高效液相色谱法测定复方苦参注射液中4种生物碱

将离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(［BMIM］BF4)作为流动相添加剂建立了同时测定复方苦参注射液中4种主要生物碱的HPLC分析方法。以Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)为分离柱,甲醇-0.1%磷酸水溶液(含2.2×10-4mol/L ［BMIM］BF4)(5:95, v/v)为流动相,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,进样量20 μL,在205 nm下检测。结果表明,苦参碱、槐定碱、氧化槐果碱以及氧化苦参碱的质量浓度分别在25.8～155.0 mg/L, 40.0～240.0 mg/L, 21.7～130.0 mg/L和37.5～225.0 mg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.9990,平均回收率(n=9)在96.2%和98.9%之间。离子液体的加入能明显改善C18柱分离生物碱的色谱峰形并提高分离度。本法简便、快速、重复性好,可用于复方苦参注射液中生物碱的分离与测定。     

液相色谱-串联质谱法快速测定水及鱼肉中的苯胺

为快速准确测定水及鱼肉中的苯胺,采用乙腈提取、高效液相色谱-串联质谱测定,建立了水及鱼肉中苯胺的快速测定方法。水样与乙腈以4：1的体积比混合,1.00 g鱼肉中加入2.00 mL乙腈,涡旋提取1 min,水样和鱼肉样品的提取液离心5 min后取上清液测定。以C₁₈柱为分离柱,乙腈-0.5%（v/v）甲酸水溶液（85：15,v/v）为流动相,目标物质在3 min内分离。在0.5~500 μg/L范围内,苯胺峰面积与内标峰面积之比与质量浓度的线性关系良好（R²>0.999）。基质加标试验结果表明,苯胺在水中的回收率分别为93.7%（加标水平为40 ng）和86.7% （加标水平为400 ng）,苯胺在鱼肉中的回收率分别为96.8%、 92.6%和81.8%（加标水平分别为5、50和500 ng）,相对标准偏差在1.5%~9.2%之间。水样和鱼肉样品中苯胺的检出限分别为0.50 μg/L和1.00 μg/kg,定量限分别为1.00 μg/L和2.00 μg/kg。应用该方法测定了从受苯胺污染的水库中采集的13份水样和12份鱼肉样品,结果表明,水和鱼肉中苯胺的最大含量分别为1943.6 μg/L和60.8 μg/kg。本方法快速、准确,适用于水和鱼肉中苯胺的快速测定。     

Development and validation of a gas chromatography/mass spectrometry method for the assessment of genomic DNA methylation

A method for the determination of DNA global methylation, taken as the ratio (%) of 5‐methylcytosine (5mCyt) versus the sum of cytosine (Cyt) and 5mCyt, via gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS), was developed and validated. DNA (2.5 µg) was hydrolyzed with aqueous formic acid 88%, spiked with cytosine‐2,4‐¹³C₂,¹⁵N₃ and 5‐methyl‐²H₃‐cytosine‐6‐²H₁ as internal standards, and derivatized with N‐methyl‐N‐(tert‐butyldimethylsilyl)trifluoroacetamide and 1% tert‐butyldimethylchlorosilane, in the presence of acetonitrile and pyridine. GC/MS, operating in single ion monitoring mode, separated and specifically detected all nucleobases as tert‐butyldimethylsilyl derivatives, without interferences, with the exception of guanosine. The method was linear throughout the range of clinical interest and had good sensitivity, with a limit of quantification of 3.2 pmol for Cyt and 0.056 pmol for 5mCyt, the latter corresponding to a methylation level of 0.41%. Intra‐ and inter‐day precision and accuracy were below 4.0% for both analytes and methylation. The matrix absolute effect, process efficiency and coefficient of variation ranged from 96.5 to 101.2%. The matrix relative effect was below 1%. The method was applied to the analysis of different human DNAs, including: nonmethylated DNA from PCR (methylation 0.00%), hypermethylated DNA prepared using M.SssI CpG methyltransferase (methylation 18.05%), DNA from peripheral blood leukocytes of healthy subjects (N = 6, median methylation 5.45%), DNA from bone marrow of leukemia patients (N = 5, 3.58%) and DNA from myeloma cell lines (N = 4, 2.74%). Copyright © 2009 John Wiley & Sons, Ltd.     

Fast sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for assaying cell lysate acetylcholine

A fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was developed for the analysis of acetylcholine (ACh) in cultured cells. [(2)H(4)]Acetylcholine (ACh-d(4)) was used as an internal standard for calibration. ACh was extracted from the cell lysate with acetonitrile (ACN)/water (80/20, v/v) and the crude extract was analyzed without further purification. Isocratic hydrophilic interaction chromatography (HILIC) with (10 mM) ammonium formate/ACN (35/75, v/v) as mobile phase was used for separation. ACh was eluted within 5 min and detected using electrospray-MS/MS in the positive ion mode. The limit of detection (LOD) was found to be 1.5f mol (0.3 nmol/L) ACh with a S/N ratio of 3:1. The approach was used for the measurement of ACh in undifferentiated SN56 cells and the ACh content was determined to be 1272+/-109 pmol/mg protein.     

固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定莲蓉馅料中的二氧化硫脲

建立了固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定莲蓉馅料中违法添加的二氧化硫脲的分析方法。采用0.05%(v/v)醋酸溶液从馅料中提取二氧化硫脲,经BOND ELUT PLEXA固相萃取柱(60 mg/3 mL)净化,采用Agilent亲水作用色谱柱(100 mm×2.1 mm,3.5 μm)分离,以0.01 mol/L醋酸铵(冰醋酸调pH至3.5)和乙腈为流动相,在多反应监测模式(MRM)下进行定性定量分析。最终,二氧化硫脲在10~1000 μg/L范围内线性关系良好,检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为8.0 μg/kg和30.0 μg/kg,方法回收率为75.3%~80.7%,相对标准偏差(n=6)不超过4.83%。此方法快速、准确、特异性强、灵敏度高、样品前处理方法简便易行,适用于莲蓉馅料中二氧化硫脲的确证与测定。     

亲水作用色谱-串联质谱法测定乳及乳制品中左旋肉碱

建立了亲水作用色谱-串联四极杆质谱测定乳及乳制品中左旋肉碱的分析方法。样品经2%(v/v)乙酸水溶液提取、乙腈沉淀蛋白质净化,以乙酸铵和乙腈为流动相,经Acquity UPLC BEH HILIC色谱柱分离后采用电喷雾质谱多反应监测(MRM)方式扫描,外标法定量。结果表明,左旋肉碱的质量浓度在1~100 μg/L范围内线性关系良好(r²> 0.99),定量限为0.01 mg/kg。标准加入法测定左旋肉碱在高、中、低3个加标水平的回收率为96.0%~103.4%,相对标准偏差(RSD)为1.2%~4.3%。该方法前处理简单、快速,检测结果准确、灵敏,可为各类乳及乳制品中左旋肉碱的含量水平测定、研究和控制提供技术支持。     

柱前衍生-超高效液相色谱法测定鱼卵中的17种氨基酸

建立了一种快速、灵敏的柱前衍生-超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器(UPLC-PDA)测定史氏鲟(Acipenser schrenckii)、达氏鳇(Huso dauricus)和小体鲟(Acipenser ruthenus)鱼卵中17种氨基酸含量的方法。采用6.0 mol/L的盐酸水解鱼卵,提取液经低压浓缩、碱性中和,然后以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)为衍生试剂在pH 8.8硼酸盐缓冲溶液中衍生化。采用的色谱分离柱为Waters BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm),流动相为30 mmol/L乙酸铵水溶液(pH 3.5)和乙腈(含0.15%(v/v)甲酸及30 mmol/L乙酸铵),梯度洗脱,流速为0.7 mL/min,在260 nm波长下检测。17种氨基酸在5.0～1000 μmol/L浓度范围内,峰面积与浓度之间的线性关系良好(r2≥0.9950)。以标准加入法测定回收率和相对标准偏差(RSD),在100、500、750 μmol/L的添加水平下,17种氨基酸的平均回收率为75.4%～107.3%, RSD为2.19%～12.3%。以3倍信噪比(S/N＞3)计方法的检出限,17种氨基酸的检出限为0.94～4.04 μmol/L。应用该方法检测了3种鲟鳇鱼鱼卵中的17种氨基酸含量。结果表明,该方法简便、准确、快速、可靠。     

分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中7种非选择性环氧化酶抑制药物

建立并优化了使用分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱（dSPE-UPLC-MS/MS）检测奶粉中7种非选择性环氧化酶（COX）抑制药物残留的方法。样品用0.01 mol/L pH 2.5抗坏血酸溶液-乙腈-乙酸乙酯（2：5：5，v/v/v）溶液提取后，加入无水硫酸钠、十八烷基键合硅胶吸附剂（C₁₈-N）及NH₂-丙基乙二胺吸附剂（NH₂-PSA）组成的盐包进行净化。以Waters CORTECS UPLC C₁₈（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）色谱柱分离，流动相为0.1%（体积分数）甲酸水溶液和0.1%（体积分数）甲酸乙腈，配合多反应监测（MRM）模式定性定量分析水杨酸、布洛芬、双氯芬酸钠、吲哚美辛、吡罗昔康、萘普生和保泰松7种成分。结果表明：7种化合物线性相关性良好，相关系数（r²）≥ 0.9957。高、中、低3个水平下，加标回收率为76.4%~89.8%。定量限为2~5 μg/kg。该方法前处理简单，回收率高，重现性好，可作为奶粉中7种非选择性COX抑制药物残留的有效检测方法。     

超高效液相色谱-串联质谱法同时测定不同饲料中30种真菌毒素

采用QuEChERS前处理技术,建立了超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测不同饲料样品(预混料、浓缩料和配合料)中30种真菌毒素含量的分析方法。饲料样品经5 mL水和5 mL含1%(v/v)甲酸的乙腈溶液提取后,取上清液氮吹至近干,残渣经1 mL 5 mmol/L醋酸铵水溶液-乙腈(80∶20,v/v)复溶后,上机测定。采用基质匹配标准曲线结合同位素内标法进行定量分析。在低、中、高3个添加水平下,30种真菌毒素的平均加标回收率为72.0%~118.4%(n=5),30种真菌毒素在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数(r 2)≥0.99,检出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)分别为0.7~20μg/L和2~50μg/L。该法简单、快速、实用性强,适用于预混料、浓缩料和配合料中30种真菌毒素的定量分析。