基于免标记发夹型探针和核酸外切酶Ⅲ的荧光信号放大DNA检测

设计合成了一种长臂发夹型核酸探针,结合核酸外切酶Ⅲ水解反应建立了一种免标记荧光信号放大高灵敏检测DNA的新方法.当不存在靶DNA时,SYBR GreenⅠ荧光染料能够嵌入发夹型探针的茎部而发出很强的荧光,而当存在靶DNA并与发夹型探针杂交后,核酸外切酶Ⅲ从杂交产物的3'端开始水解发夹型探针,释放出靶DNA,并触发下一个酶水解反应,同时SYBR GreenⅠ染料也随发夹型探针水解而释放,导致荧光信号降低,从而实现了对DNA的免标记荧光信号放大高灵敏检测.该方法的检出限低至320 fmol/L,比传统双标的分子信标的方法降低了4~5个数量级,且该方法还具有免标记、简单、快速的特点.     

基于链置换循环无标记检测端立酶RNA的荧光法

以氧化石墨烯(GO)作为DNA载体和荧光猝灭剂,SYBRGreen Ⅰ(SGⅠ)为荧光信号探针,发夹核酸探针为分子识别探针,基于目标物启动的发夹核酸探针链置换循环反应,建立了一种利用荧光共振能量转移和链置换循环放大技术检测端粒酶RNA (hTR)的荧光新方法.发夹核酸探针hpDNA1和hpDNA2吸附在GO表面,嵌插在发夹DNA探针茎部的SG Ⅰ的荧光信号被GO猝灭.当人工合成的目标物(T1)存在时,T1与hpDNA1杂交打开hpDNA1的茎-环结构而引发hpDNA2与T1之间的链置换循环反应,由此累积产生大量的hpDNA1/hpDNA2杂交双链.刚性的双链DNA脱离GO表面,导致所嵌插的SG Ⅰ产生较强的荧光信号.基于荧光信号的变化,可定量检测0.2～50 nmoL/L的T1,检出限为90 pmol/L.该方法为端粒酶RNA检测提供了一种高灵敏、高特异性且无需标记的荧光新途径.     

基于链置换循环无标记检测端粒酶RNA的荧光法

以氧化石墨烯(GO)作为DNA载体和荧光猝灭剂, SYBR Green Ⅰ(SGⅠ)为荧光信号探针, 发夹核酸探针为分子识别探针, 基于目标物启动的发夹核酸探针链置换循环反应, 建立了一种利用荧光共振能量转移和链置换循环放大技术检测端粒酶RNA(hTR)的荧光新方法. 发夹核酸探针hpDNA1和hpDNA2吸附在GO表面, 嵌插在发夹DNA探针茎部的SGⅠ的荧光信号被GO猝灭. 当人工合成的目标物(T1)存在时, T1与hpDNA1杂交打开hpDNA1的茎-环结构而引发hpDNA2与T1之间的链置换循环反应, 由此累积产生大量的hpDNA1/hpDNA2杂交双链. 刚性的双链DNA脱离GO表面, 导致所嵌插的SGⅠ产生较强的荧光信号. 基于荧光信号的变化, 可定量检测0.2~50 nmol/L的T1, 检出限为90 pmol/L. 该方法为端粒酶RNA检测提供了一种高灵敏、 高特异性且无需标记的荧光新途径.     

基于双酶切级联信号放大的核酸检测方法

利用茎环结构定位探针构建了一个基于双酶切反应的级联信号放大体系,并将其用于核酸的检测.在该体系中,茎环结构定位探针首先是内切酶Tth EndonucleaseⅣ的作用底物,被剪切后又作为定位探针介导切口酶Nt.Bst NBI对分子信标实施剪切,将这2步剪切反应结合起来可有效克服切口酶对于目标核酸中特定识别序列的依赖,同时进一步提高了检测灵敏度.实验结果表明,荧光信号与目标DNA浓度的对数值呈线性相关,响应范围为1 pmol/L～1 nmol/L,并且具有良好的识别单碱基变异的能力.此外,本方法序列设计简单,通用性强,仅改变定位探针的部分序列即可实现对不同目标DNA的检测.对掺杂于血清中的目标DNA的检测结果验证了本方法在实际样品检测中的应用潜力.     

双链特异性核酸酶介导的高灵敏度microRNA分析

基于氧化石墨烯(GO)对荧光标记单链DNA探针的荧光猝灭效应以及双链特异性核酸酶(DSN)选择性切割DNA/RNA杂合结构中DNA单链的特性,本文建立了一种新型恒温信号放大方法用于microRNA(miRNA)的高灵敏度检测.靶标miRNA首先与荧光DNA探针杂交,DSN能够特异性地将杂合双链中的DNA探针水解为碎片但不会降解miRNA,GO对酶切产生的寡核苷酸碎片吸附能力显著降低,使得荧光基团远离GO表面而不被猝灭.释放出的miRNA可再次发生与荧光DNA探针杂交、DSN酶切等反应,如此反复,可实现恒温条件下一个miRNA分子与多个探针杂交、酶切、释放荧光基团的循环过程,最终体系的荧光信号得到显著放大,通过记录体系的荧光信号即可实现对靶标miRNA的灵敏检测.     

发夹型荧光分子探针用于DNA甲基化酶的活性分析及其在药物筛选中的应用

报道了一种基于发夹型荧光探针的甲基化酶活性的分析方法, 甲基化酶和相应的限制性内切酶的识别位点被设计在发夹型探针的茎部, 四甲基罗丹明(TAMRA)被连接在探针的5'端, 其荧光被连在3'端的熄灭基团4-(4'-二甲基对胺基偶氮苯)苯甲酸(DABCYL)所熄灭. 限制性内切酶可切割未发生甲基化修饰的探针, 导致探针的发夹结构遭到破坏, 引起TAMRA荧光信号的恢复. 根据荧光信号的恢复程度可实现对甲基化酶活性的分析. 在此基础上, 建立了一种简便、快速分析抗肿瘤药物对DNA甲基化酶活性的影响的方法, 为筛选针对基因甲基化异常引起的恶性肿瘤的治疗药物提供了一种新的思路和方法.     

基于纳米金探针和基因芯片的DNA检测新方法

运用荧光纳米金探针和基因芯片杂交建立一种新的DNA检测方法. 荧光纳米金探针表面标记有两种DNA探针: 一种为带有Cy5荧光分子的信号探针BP1, 起信号放大作用; 另一种为与靶DNA一部分互补的检测探针P532, 两种探针比例为5∶1. 当靶DNA存在时, 芯片上捕捉探针(与靶DNA的另一部分互补)通过碱基互补配对结合靶DNA, 将靶DNA固定于芯片上; 荧光纳米金探针通过检测探针与靶DNA及芯片结合, 在芯片上形成“三明治”复合结构, 最后通过检测信号探针上荧光分子的信号强度来确定靶DNA的量. 新方法检测灵敏度高, 可以检测浓度为1 pmol/L的靶DNA, 操作简单, 检测时间短. 通过改进纳米金探针的标记和优化杂交条件, 可进一步提高核酸检测的灵敏度, 这将在核酸检测方面具有重要的应用价值.     

非标记型p53抑癌基因电化学DNA生物传感器的研究

基于发夹型核酸探针的高特异性识别能力以及电活性物质与DNA磷酸骨架间的静电作用,以发夹型核酸作为分子识别探针,电活性物质六氨合钌(RuHex)作为杂交指示剂,构建了一种非标记型检测p53抑癌基因的电化学DNA生物传感器.实验结果表明,在10 μmol/L RuHex溶液中,该传感器对目标DNA具有灵敏的电化学响应,电化...     

基于杂交链式反应信号放大和磁分离技术荧光检测端粒酶活性

端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶, 它一般在癌细胞中被激活. 它与端粒DNA的不断复制以及癌细胞的不断增殖密切相关. 所以检测端粒酶的活性对癌症的早期诊断以及以端粒酶为靶标分子的抗癌药物的开发具有重要意义. 利用杂交链式反应(HCR)无酶放大检测信号, 建立了一种简单、快速的端粒酶活性检测方法. 端粒酶延伸产物是一条末端具有(ggttag)_n重复序列的DNA. 在实验过程中, 通过链霉亲合素与生物素的特异性作用将端粒酶延伸产物连接在磁性微球上. 设计一条端粒酶延伸产物特异性的DNA探针I作为杂交链式反应的引发探针. DNA探针I的3'-端与端粒酶延伸产物的重复序列匹配, 通过杂交, DNA探针I被固定在磁球上; DNA探针I的5'-端引发DNA探针II和探针III发生杂交链式反应. DNA探针II和探针III上都标记有荧光基团, 可以利用荧光直接进行信号检测. 在反应过程中, 通过磁分离去除多余未反应的三种DNA探针. 在优化条件下, 可以检测到1.0×10⁵个Hela细胞中的端粒酶活性. 该方法简单、快速、检测成本低, 分析全程无酶参与, 在肿瘤或癌症的临床诊断以及以端粒酶为靶标分子的抗癌药物的筛选上具有广阔的应用前景.     

基于酶辅助靶标循环的适体传感器灵敏检测中药中黄曲霉毒素B1

该文基于酶辅助靶标循环信号放大策略构建了用于黄曲霉毒素B1(AFB1)高灵敏检测的化学发光适体传感器。以G-四链体/氯化血红素DNA酶为信号分子设计了免标记的适体探针H1-S1和发夹探针H2。适体探针结合目标AFB1,在核酸外切酶I辅助下,触发靶标循环反应产生发夹H1。发夹H1与H2杂交,释放出完整的G-四链体序列,并进一步与氯化血红素结合形成G-四链体/氯化血红素DNA酶。DNA酶通过催化氧化鲁米诺-H2O2化学发光体系产生化学发光信号,实现AFB1的放大检测。在最优实验条件下,化学发光强度与AFB1质量浓度的对数在0.001~100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,相关系数(r2)为0.9955,检出限为0.93 pg/mL,回收率为93.7%~107%。该适体传感器操作简单、灵敏度高、特异性好,在黄曲霉毒素污染检测方面具有良好的应用前景。     

增强型超分子荧光探针对拉帕替尼的识别及其在细胞成像中的应用

通过超分子识别设计了八元瓜环与派洛宁Y超分子荧光探针2PyY@Q[8],研究了该探针对抗癌药物拉帕替尼的识别性质.研究结果表明,该探针在水溶液中对拉帕替尼具有良好的识别能力及选择性,在一定浓度范围内其线性关系良好,其检出限为1.44×10~(-8) mol/L.细胞成像结果显示该探针在前列腺癌细胞中对拉帕替尼具有很好的响应,可用于生物细胞内拉帕替尼的识别检测.     

基于链替代信号放大灵敏检测端粒酶活性的电化学方法

利用标记二茂铁基团的DNA(T-DNA)分子作为信号探针, 基于端粒酶特异性延长其底物链(TS)所引发的链替代反应, 建立了一种检测端粒酶活性的电化学信号放大法. 将巯基化的发夹型DNA分子(H-DNA)通过金-硫键自组装于金电极表面, 辅助DNA(A-DNA)与二茂铁修饰的T-DNA部分互补杂交形成双链AT-DNA; 当端粒酶存在时, 可在TS的3′末端合成TTAGGG的重复序列; A-DNA与TS延长链杂交置换出T-DNA; T-DNA与发夹H-DNA杂交使得二茂铁靠近电极表面; 一条TS延长链可以释放出多条T-DNA, 将二茂铁富集到金电极表面, 从而实现信号放大检测端粒酶活性. HeLa细胞个数在5~100范围内与电流值成正比, 最低可检测5个HeLa细胞中端粒酶的活性. 因此, 本文建立了一种简单灵敏检测端粒酶活性的电化学方法.     

基于分子发夹/荧光微球的侧向层析法定量检测黄曲霉毒素B1

基于分子发夹/荧光微球探针构建了一种侧向层析定量检测黄曲霉毒素B1(AFB1)的新方法。一条含有AFB1适配体的分子发夹与荧光微球偶联后,形成的标记探针被喷涂在试纸条的结合垫上。一条5'端含有链霉亲和素的寡核苷酸序列包被在硝酸纤维素膜的检测线上,另一条包含有AFB1适配体互补链的寡核苷酸序列包被在硝酸纤维素膜的质控线上。当待测样本中含有AFB1时,AFB1先与标记物结合垫处标记探针中的AFB1适配体结合,同时,标记探针中的DNA分子发夹‘茎’的双链被打开,AFB1与标记探针形成的复合物层析到反应膜的检测区时,被检测区的寡核苷酸序列捕获,检测区出现亮线。利用该原理,通过一个"off-on"的光信号,实现了对AFB1的高灵敏检测。实验结果表明,AFB1在0.1~50μg/L质量浓度范围内,检测线处的荧光强度(T)和质控线荧光强度(C)的比值与AFB1质量浓度呈良好的线性关系,检出限(S/N=3)达0.05μg/L,且具有很高特异性,可实现对实际样品中AFB1的准确检测。     

谷胱甘肽和凋亡酶-3响应的环肽分子荧光探针

设计、合成了一类新型谷胱甘肽(glutathione,GSH)和凋亡酶-3(Caspase-3)响应的环肽分子荧光探针.该类探针主要由能量共振转移(FRET)分子荧光对、Caspase-3特异性识别多肽序列和GSH响应双硫键组成,分为不含穿膜肽序列(CP)和包含穿膜肽序列(cp CP)的两种不同环肽分子荧光探针.2种环肽分子荧光探针均能实现在GSH和Caspase-3同时存在情况下的精确成像,同时具有良好的响应性、特异性和高信噪比.该类环肽分子荧光探针在细胞培养环境中具有良好的稳定性和生物相容性.利用该探针,可以实现对星形孢菌素(STS)诱发的细胞凋亡进行实时、原位的成像监测,并对抗肿瘤药物阿霉素(DOX)和顺铂(cisplatin)诱导的细胞凋亡进行成像.这种具有多重响应并能用于精确成像的分子荧光探针将极大地促进疾病的精确诊断.     

一种新型荧光探针--分子信标的研究及应用进展

分子信标是一种基于荧光能量转移原理而设计的发夹型寡聚核酸荧光探针。它通过与核酸等靶分子相互作用后发生构象的变化而产生荧光信号,对靶分子的检测具有灵敏度高、选择性强、适合于活体实时检测等优点。目前已广泛应用于生物化学分析、生物医学研究和环境监测等各领域。本文对分子信标的设计原理及其研究和应用进展进行了综述。     

基于新型萘环稠合硼氟二吡咯化合物(BODIPY)的氟离子荧光探针及其细胞成像研究

设计、合成了一种基于新型萘环稠合硼氟二吡咯化合物(BODIPY)5的氟离子比率计量型和荧光猝灭型分子探针.通过紫外-可见光谱实验发现,该探针在氟离子存在时光谱红移100nm,进入近红外区域,可用于肉眼比色检测.荧光光谱分析表明,氟离子可促使荧光猝灭.细胞成像研究表明探针分子5可在活体细胞中专一性地识别氟离子.     

蛋氨酸亚砜还原酶荧光探针的设计及应用

蛋氨酸亚砜还原酶(Msr)是一类很好的抗氧化酶和蛋白修复酶,在生物体氧化还原体系中扮演着重要的角色.本文依据其反应特异性及分子探针发光机制,设计合成了可用于检测蛋氨酸亚砜还原酶活性的探针Msr-TFMCM,并详细研究了其与Msrs的相互作用及反应机理.在此基础上,将Msr-TFMCM进一步用于活细胞内Msrs活性的可视化检测.在培养的细胞中预先加入Msrs的底物蛋氨酸亚砜可以显著抑制荧光信号,说明了探针可以实现对Msrs的专一性检测.     

高灵敏线粒体靶向近红外二氧化硫荧光探针的开发及细胞、小鼠成像研究

二氧化硫(SO₂)及其衍生物(亚硫酸盐、亚硫酸氢盐等)作为活性硫物种的重要组成部分,与生命体的生理过程有着密切的关系.此外,摄入过量的SO₂会对呼吸系统造成不可修复的损伤,例如呼吸系统损伤、心脑血管和神经疾病等.近红外发射荧光探针具有较强的组织穿透能力,可以有效地检测活体内的生物分子.因此,设计了一种基于迈克尔加成(Michael Addition)机理的线粒体靶向近红外SO₂荧光探针XA-SO₂.溶液光谱实验表明,该探针XA-SO₂对SO₂有着显著的选择性和灵敏度,并且具有快速检测SO₂的能力.值得注意的是,该荧光探针XA-SO₂具有较好的细胞膜渗透能力,成功检测到了细胞外/内源性SO₂.更重要的是,该探针XA-SO₂能够有效地在细胞的线粒体上富集,有望实现细胞线粒体内SO₂的动态检测.     

分子动力学模拟研究荧光分子芘在磺基甜菜碱胶束中的增溶

采用分子动力学模拟研究了荧光分子芘在磺基甜菜碱两性表面活性剂聚集体中的增溶现象．结果表明,芘分子自发地自溶液中增溶进入胶束疏水内核的栅栏层区域．当胶束溶液中芘分子的局部浓度增大时,两个芘分子可以同时增溶进胶束的栅栏层区域,此时两个芘分子形成π-π共轭堆积的激发态络合物．但是由于荧光分子之间的弱兀．兀相互作用,激发态络合物在胶束中是不稳定的,表现为两个芘分子的多次结合和分离．模拟表明,分子动力学方法可以在分子水平上研究荧光探针分子在表面活性剂胶束中的增溶位点,解释荧光分子在胶束中的动力学现象．     

一种基于目标介导核酸链置换扩增反应的电化学传感器用于赭曲霉毒素A的检测研究

本文利用聚多巴胺纳米微球(Polydopamine Nanospheres, PDANS)作为富集功能核酸的载体材料，并结合链置换扩增(Strand Displacement Amplification, SDA)技术，构建了一种可用于超灵敏检测赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)的电化学传感方法。实验精细设计了一段整合了OTA适配体、扩增所需的引物和模板三种功能的发夹型DNA序列，并通过π-π作用吸附在PDANS表面。在PDANS的保护下，溶液中的核酸酶无法顺利消解吸附发夹型DNA,从而阻碍SDA的进行。在此条件下，带正电荷的电活性物质亚甲基蓝(MB)可以自由迁移到ITO电极表面，产生强电流信号。当OTA存在时，OTA与发卡DNA中的适配体相结合，引起发夹DNA构型变化而脱离PDANS表面。随后，在核酸内切酶和聚合酶的帮助下启动SDA反应，产生大量带负电荷的双链DNA(dsDNA)。此时，溶液中的MB分子通过静电相互作用而嵌入dsDNA沟槽中，从而使得ITO表面的电活性探针MB的数量减少，导致电流下降。该方法对OTA的检出限可以达到21 pmol/L,且无需标记和探针固定...