利用色谱法研究α－淀粉酶变性动力学

提出用尺寸排阻色谱法研究酶的变性动力学。此法将高效色谱分离同灵敏的紫外检测结合起来,消除了紫外法测定蛋白质变性速度时变性体的影响。确定了个淀粉酶在盐酸胍溶液中变性时的反应级数,测定了不同浓度变性剂中酶的变性速度常数,并和失活速度常数进行了比较,讨论了影响酶变性速度的因素。     

肌酸激酶在胍溶液中的变性与失活速度的比较

本文以紫外差光谱、荧光光谱为监测手段测定肌酸激酶的变性与失活过程均为一级反应。在3M胍溶液中,30℃测得的失活速度常数为5.9秒~(-1),变性速度常数为1.9秒~(-1)。1M胍变性时,失活速度常数为4.3秒~(-1),而交性速度常数明显降低为0.04秒~(-1)。0.5M胍变性时,失活为两个一级过程,其速度常数分别为3.6秒~(-1)与0.003秒~(-1),此外酶还保持有3.4％的剩余活力;变性速度常数为0.004秒~(-1)。在0.3M胍中,酶的紫外差吸收及荧光变化都很小,但是60％的活力仍然迅速丧失,最后还保持有30％剩余活力。上述结果表明,酶的活性部位可能比较脆弱。酶分子双体的解聚或盐酸胍的抑制作用也可能引起酶的快速失活。低浓度胍变性时,失活过程的多相性意味着可能存在有部分活力的中间态。     

氨基酰化酶在脲溶液中变性时构象变化速度与失活速度的比较

应用了邹氏不可逆抑制动力学的方法,在变性剂存在的条件下,连续监测酶催化的底物反应过程,测定了氨基酰化酶在不同浓度脲溶液中失活的速度常数,并考察了底物的存在对酶失活的保护作用。同时,还比较了氨基酰化酶在不同浓度脲溶液中变性时失活和构象变化的速度。1mol/L,2mol/L脲变性时失活速度常数为为1.62×10~(-2)S~(-1)和2.05×10~(-2)S~(-1),但是酶分子的整体构象尚未发生明显变化。3mol/L脲变性时,失活速度常数为2.56×10~(-2)S~(-1),而变性速度常数为3.72×10~(-3)S~(-1)。失活速度比构象变化速度快大约一个数量级。在4mol/L,5mol/L,6mol/L脲溶液中变性时,酶分子快速失活,而其构象变化速度常数分别为5.27×10~(-3)S~(-1)。5.47×10~(-3)S~(-1),5.56×10~(-3)S~(-1)。可见,在相同浓度的脲溶液中,氨基酰化酶的失活速度明显快于酶分子整体构象变化的速度。上述结果表明,含有辅基金属离子Zn~(2+)的氨基酰化酶的活性部位较酶分子的整体结构也具有一定的柔性。     

肌酸激酶变性过程中圆二色光谱变化及巯基暴露的速度

本文以 CD光谱及巯基测定两种方法监测了肌酸激酶的变性过程.快速可反应巯基的测定表明,巯基暴露速度与从前报道过的荧光光谱及紫外差光谱的变化速度大体相当.但是,在低浓度胍溶液中,隐蔽的芳香氨基酸尚未暴露时,酶分子的椭圆度值已有了明显可察的变化.变性速度的比较表明,220nm平均残基椭圆度值的变化速度明显地慢于芳香氨基酸、巯基的暴露速度.这可能意味着,肌酸激酶分子内某些肽段具有松散的二级结构,又靠近分子表面,易受到低浓度胍的变性作用.而整个酶分子的二级有序结构的破坏,还是慢于卷曲肽链的伸展速度,也即三级结构的破坏速度。     

镍离子与酵母乙醇脱氢酶的相互作用

不同体系中, 金属离子与蛋白以不同的结合方式相互作用. 酵母乙醇脱氢酶是一个含锌金属酶, 它可催化乙醇脱氢为乙醛的反应. 本文应用紫外-可见光谱、荧光光谱、差示扫描量热法等技术研究了二价镍离子与酵母乙醇脱氢酶的相互作用. 镍离子与酶结合后在320 nm出现了紫外吸收带, 同时荧光光谱反映了酶的构象变化, 紫外与荧光光谱均展现了结合过程的双相动力学. 镍离子与酶的相互作用导致了酶由四聚体向二聚体的解离; 在酶热变性过程中, 镍离子增加了乙醇脱氢酶的变性温度和变性焓. 研究工作揭示了镍离子与酶相互作用复杂和深层的作用机制.     

基于阳离子共轭聚合物比色检测HIV逆转录酶的RNase H活性

利用阳离子聚噻吩衍生物与单链DNA和杂合体DNA/RNA通过静电相结合时所产生的紫外吸收变化,建立了一种检测HIV逆转录酶(RT-HIV)的RNase H活性的方法。阳离子聚噻吩衍生物的紫外吸收最大波长位于短波385nm,与单链DNA结合会使聚噻吩衍生物的紫外吸收最大波长红移至525nm;而与杂合体DNA/RNA结合时对其紫外吸收最大波长几乎没有影响,当利用RT-HIV的核糖核酸酶RNase H活性水解掉杂合体中的RNA时,杂合体溶液又会使聚噻吩衍生物的紫外吸收最大波长发生红移。结果表明,紫外吸收最大波长变化明显,甚至直观用肉眼就可以观察到杂合体水解前后溶液颜色的变化。同时还测定了不同时间下RNase H酶水解杂合体中RNA的吸光度变化曲线,计算出了RNase H酶水解的动力学常数和最大初速度。     

大豆中脲酶活力的玻璃电极法测定

本文用玻璃电极电位法研究了大豆及脲酶制剂中脲酶活力的测定和酶的反应动力学，测定了米氏常数ＫＭ以及酶催化反应最大速度ｒｍ，方法快捷简便。     

介体型酶电极二级催化反应速度常数的测定

采用开路驰豫法，测定了以二茂铁及其衍生物作为电子传递体的介体型酶电极的均相二级催化反应速度常数，结果表明二甲氨基甲基二茂铁，在绝氧条件下对于酶的再生反应具有高的催化活性，是一种性能优良的电子传递体．此外，讨论了开路弛豫法在酶电极研究中的适用条件及各种因素对该方法测定结果的影响．     

紫外光谱法实时测定腈水合酶的催化动力学

采用紫外光谱法研究了腈水合酶催化丙烯腈水合的过程,在不同丙烯腈初始浓度下,测定了催化过程中275nm紫外吸光度的变化,计算出丙烯酰胺的生成速率.用Michaelis-Menten方程对不同丙烯腈浓度下的Nocardiasp.腈水合酶催化速率进行了拟合,得到该酶以丙烯腈为底物的米氏常数(K_m)为8.46mmol/L,单位质量腈水合酶的催化速率常数(k_cat)为2398μmol/(min·mg).     

修饰脂肪酶催化水解反应的动力学和热力学研究

采用邻苯二甲酸酐(PA)对猪胰脂肪酶(PPL)进行了化学修饰,以三硝基苯磺酸法测定修饰酶的平均氨基修饰度,并比较了酶修饰前后的紫外光谱和荧光光谱;采用动力学方法考察了酸碱和热对修饰酶水解活性和稳定性的影响,并计算了一系列动力学和热力学参数.实验结果表明:PA对PPL的修饰度为30%,脂肪酶PPL经PA修饰后,其紫外特征吸收峰发生红移,吸收强度降低,而且最大荧光发射峰发生蓝移,荧光强度增大;PPL经PA修饰前后,催化水解反应的最适pH和最适温度未发生变化,仍为pH7.5和40℃,但修饰后酶催化水解的效率和酶与底物的亲和力得到有效提高,反应的活化能Ea、自由能ΔG≠、活化焓ΔH≠及活化熵ΔS≠均明显降低,如最适条件下修饰酶PA-PPL和脂肪酶PPL的转化数kcat和反应的活化能Ea分别为39.8 s-1、25.8 kJ/mol和34.4s-1、43.8kJ/mol;PPL经PA修饰后,酶分子热变性的热力学参数(变性活化能Ea,d、变性自由能ΔGd≠、变性活化焓ΔHd≠及变性活化熵ΔSd≠)均增大,半衰期t1/2延长,酶分子的热稳定性也得到有效提高.     

pH值对亚甲基蓝/β-环糊精包合常数的影响

本文用紫外-可见分光光度法测定了亚甲基蓝/β-环糊精包合物的包合平衡常数(简称包合常数K)。并探讨了包合物溶液放置时间、亚甲基蓝初始浓度、溶液pH值对包合常数的影响。结果表明:亚甲基蓝/β-环糊精包合物的包结比为1∶1,溶液放置时间和亚甲基蓝初始浓度不影响亚甲基蓝/β-环糊精的包合常数,溶液pH对包合常数有较大的影响,pH=3~10时包合常数随pH值的增加而增加,包合常数在pH=7时为1×104L/mo。l     

聚羟基烷酸酯酶降解动力学研究

研究了羟基丁酸 羟基戊酸共聚物 (PHBV)在脂肪酶中的降解行为 ,用滴定法测定降解速度并进行酶促反应动力学研究 .探讨了降解速度与酶浓度和底物浓度的数学关系和Michaelis Menten常数 ,从实验上和理论上证实了PHBV的物理形态和几何尺寸对酶降解过程的影响 ,以及实验数据与非均相动力学模型的拟合     

微量热法研究过氧化氢酶反应

利用微量热法和热动力学方程研究了过氢化氢酶反应.该反应遵循Michaelis-Menten动力学,298.15K和pH7.0时,其米氏常数、酶转换数以及摩尔反应焓分别为2.36×10^-2mol/L、1.20×10⁴s^-1和-83.67kJ·mol^-1.过氧化氢酶反应后期对底物是一级反应,其总反应速度常数和一级速度常数分别为k_o=6.31×10⁵L·mol^-1·s^-1和k₁=6.31×10⁵/[E_o]s^-1.该反应服从Ogura机理,其酶-底物三元复合物的分解速度常数为6.00×10³s^-1.     

介绍一个酶催化反应动力学实验

在恒电位下,通过测定聚苯胺葡萄糖氧化酶电极反应时的电流来测定酶催化反应的速度、底物浓度、表观米氏常数和反应活化能。该实验方法准确、可靠、方便。     

微量热法研究黄嘌呤氧化酶反应

在热导工热量计双参数理论模型的基础上，建立了较快酶仲反应研究的双参数初始速度法的热动力学模型，用微量热法研究了黄嘌呤氧化酶催化氧化黄嘌呤的热动力学，该较快酶促反应遵循Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ这，在２９８．１５Ｋ和ＰＨ＝７．５时，其米氏常数为１．０４×１０＾－３ｍｏｌ．Ｌ＾－１，与文献结果相符。     

光谱和电化学方法研究自组装纳米簇模拟过氧化物酶

利用细胞色素c与Nafion,通过自组装方式,构建了纳米簇模拟过氧化物酶;利用电子透射显微镜、圆二色谱仪、紫外可见光分光光度仪及电化学工作站等设备测量模拟酶结构变化、酶促动力学参数以及电化学特性;在50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(pH 10.0)中,测得模拟酶米氏常数Km、催化速率及催化效率分别为2.5 μmol/L、0.069 s-1、0.028±0.005(μmol/L)-1s-1,其催化效率为天然辣根过氧化物酶的39％±5％,该模拟酶具有很好的稳定性和活性,能够替代辣根过氧化物酶.该模拟酶可以固定在功能化多壁纳米管与纳米金复合材料修饰玻碳电极上,在50 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(pH 7.0)中测得模拟酶与电极之间电子迁移速度常数k8为0.65 s-1.利用循环伏安法测量模拟酶催化浓度为0.02～10 nmol/L的H2O2,其阴极峰电流随H2O2浓度增加而增大,并且得出模拟酶催化H2O2检出限为0.05 nmol/L,电化学表观米氏常数Kmapp为2.3×10-10 mol/L.     

钴(Ⅱ)与金属硫蛋白的反应

研究了Ｃｏ（Ⅱ）和金属硫蛋白反应的动力学，发现反应分三段进行，由此得到了不同条件下各段对应的假一级反应速率常数。假设金属硫蛋白中每个金属结合２０／７个ＳＨ基团，用盐酸滴定ＣｏＴｈ（ｔｈｉｏｎｃｉｎ）和Ｃｏ７Ｔｈ，根据它们的紫外光谱特征波长处吸收值降至５０％时的ＰＨ，分别又得到它们的表观平均稳定常数。     

自由基照像光显影研究——能量转移机理及动力学

研究了重原子化合物及各种气氛对四溴化碳-无色结晶紫自由基片光显影速度的影响。当片子中有重原子化合物碘仿,对碘苯胺或三苯基铋,或者片子置于氮气中光显影时,显影速度明显增加;在氧气中显影速度大大下降。氮气中的显影速度常数K₀。与氯氧混合气体中显影度常数K满足如下关系: K₀/K=1+a[O₂]式中a为淬灭常数。因此,证明是三线态-三线态传能。 实验证明,在光显影主期中,满足D=D₀+Kt动力学关系。式中D为光密度,D₀为光密度常数,K为光显影速度常数,t为显影时间。     

含双dppz配体的钌(Ⅱ)配合物与G-四联体的相互作用研究

应用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、热变性、圆二色谱等方法在K+溶液中研究了富含鸟嘌呤的G-四联体(AG3(T2AG3)3)与钌髤配合物[Ru(L)(dppz)2](PF6)4(L=5,5′-二(三正丁胺基甲基)-2,2′-联吡啶离子,dppz=二吡啶并[3,2-a∶2′,3′-c]吩嗪)的相互作用。紫外和荧光滴定实验表明,配合物与G-四联体之间存在较强的亲和力,拟合得到的结合常数可达107;从热变性实验可以看出,该配合物能够有效地稳定DNA的四螺旋结构。     

嗪草酮与脱氧核糖核酸相互作用的研究

采用电化学方法,结合紫外-可见分光光度法、荧光光度法、粘度法和与变性脱氧核糖核酸(DNA)的作用研究了嗪草酮(M)与DNA的作用机制,并通过研究嗪草酮对溴化乙锭-天然DNA体系的影响,以及天然DNA和变性DNA与嗪草酮的作用的不同,得出嗪草酮与DNA分子发生类似溴化乙锭(EB)嵌插作用的结论,形成DNA-M 1∶1型的超分子化合物DNA-M。求得结合常数β=1.8×105L/mol。DNA加入量在1×10-5~1.5×10-4mol/L范围内,DNA浓度与峰电流降低值之间存在线性关系。