白缘(鱼央)微卫星分子标记的筛选

用磁珠-生物素标记的微卫星探针(ACA)15与白缘缺(Leiobagrus marginatus)基因组酶切片段杂交,捕获含有微卫星序列的DNA片段,连接到T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库,再用γ-32P标记的探针进行二次筛选,获得阳性克隆785个,对其中的140个克隆进行了测序,获得完整的微卫星序列132个．用引物设计软件Primer Premier 5．0设计引物64对．对其中的20对引物进行了多态性检测,筛选到稳定扩增的标记13对,用此13对微卫星引物分析了缺属白缘缺(L．marginalus)、拟缘缺(L．marginatoides)(大、小各1种)、黑尾缺(L．nigricauda)共4个群体的遗传多样性,其中10对微卫星引物在种内或种间表现出多态性．     

白缘缺微卫星分子标记的筛选

用磁珠-生物素标记的微卫星探针（ACA）15与白缘缺（Leiobagrus marginatus）基因组酶切片段杂交，捕获含有微卫星序列的DNA片段，连接到T载体中，构建富集微卫星序列的小片段插入文库，再用γ^-32P标记的探针进行二次筛选，获得阳性克隆785个，对其中的140个克隆进行了测序，获得完整的微卫星序列132个．用引物设计软件Primer Premier5．0设计引物64对．对其中的20对引物进行了多态性检测，筛选到稳定扩增的标记13对，用此13对微卫星引物分析了缺属白缘缺（L．marginalus）、拟缘缺（L．marginatoides）（大、小各1种）、黑尾缺（L．nigricauda）共4个群体的遗传多样性，其中10对微卫星引物在种内或种间表现出多态性．     

卵形鲳鲹微卫星分子标记的筛选

本研究通过生物素与链霉素的强亲和性原理,采用生物素-磁珠吸附微卫星富集法筛选卵形鲳鲹的微卫星分子标记序列.从201个菌落中挑选出152个阳性克隆进行测序,成功测序137个,微卫星含量达到90.13%,共得到131个重复次数在6次以上的微卫星DNA序列,除生物素探针中使用的CA重复外,还得到TG、TC、GA、ATTT的重复序列.其中完美型85个,占64.9%;非完美型36个,占27.5%;混合型10个,占7.6%.利用PrimerPremier5.0设计引物90对,挑选其中的60对引物进行合成和PCR筛选,结果显示,35对引物可扩增出特异性条带.筛选的卵形鲳鲹微卫星分子标记具有多态性,可用于遗传多样性分析.     

寒兰转录组SSR信息分析及其分子标记开发

寒兰(Cymbidium kanran)是中国传统名花,其观赏与经济价值极高。简单重复序列(simple sequence repeats,SSR),又名微卫星标记,有多态性高,非共显性等优势。基于转录组数据对SSR标记的开发具有经济效能高等优点,通过高通量测序平台对寒兰EST-SSR标记进行开发,了解其在转录组序列中的分布类型及特性,为寒兰的SSR多样性的分析及遗传图谱构建奠定基础。通过MISA程序筛选寒兰转录组测序得到的68699条unigene(序列总长60.06 Mb),并分析了其SSR位点分布情况,获得了9837个SSR位点,在总unigene的比例为14.32%,平均每6.25kb出现1个SSR。SSR位点中二核苷酸重复频率达到最高,占55.22%,其中AG/CT高达38.83%;接下来为三、单核苷酸重复,频率依次为25.37%和14.49%。利用Primer3共设计出6017对SSR引物。随机选取141对引物进行PCR扩增,有79对引物扩增得到的条带清晰可重复,15对在15个不同地区寒兰中表现出多态性。结果表明,本研究中设计的SSR引物在寒兰遗传多样性分析中具有较高的适用性,可用于寒兰的遗传研究。     

外显子拼接法合成真菌灵芝漆酶基因cDNA

为真菌漆酶基因cDNA的克隆提供了一种简便快速的新方法．从含有内含子的灵芝漆酶基因出发，采用外显子拼接PCR方法，合成了灵芝漆酶的cDNA．设计了10对引物分别经PCR扩增该基因的10个外显子，引物设计使前一个外显子的下游引物与下一个外显子的上游引物都有一段同源匹配序列，然后通过两两片段混合作为模板PCR扩增得到两两拼接的外显子片段，再将得到的5个片段前两个混合，后3个混合分别作为模板扩增获得拼接好的外显子1～4大片段和外显子5～10大片段，最后将这两个大片段混合作为模板扩增得到拼接好的全长cDNA序列．与常规方法相比，该方法既避免了RNA的操作，又不用摸索酶表达的条件，可以和基因组步行技术结合快速获得真菌漆酶基因的cDNA．     

凡纳滨对虾基因组fosmid文库的构建及钙离子通道基因的筛选

本研究构建了凡纳滨对虾的基因组fosmid文库,该文库包含大约1.1×105个克隆,插入片段平均长度大于35 kb.根据和果蝇钙离子通道基因同源的凡纳滨对虾EST序列设计引物,对文库进行了PCR筛选,得到1个阳性克隆,测序结果显示该克隆包含有钙离子通道基因.研究结果为凡纳滨对虾的基因克隆和分子选育等研究奠定了基础.     

鄱阳湖流域华溪蟹属DNA条形码

探讨DNA条形码分子标记作为华溪蟹属(Sinopotamon)淡水蟹类辅助分类工具的可行性。选取分布于鄱阳湖流域的6种华溪蟹属淡水蟹类78个样本,采用线粒体COI和16SrRNA基因片段以及ITS2核基因片段,作为分子标记,结合GenBank数据库中同属序列片段,经DNA提取、引物筛选、PCR扩增、产物纯化测序及测序数据处理和分析,在计算得到的遗传距离和所构建系统发生树进行华溪蟹DNA条形码标准基因的选择。在本实验涉及的淡水蟹类个体及类群的识别上,16SrRNA和ITS2基因片段不适宜作为DNA条形码标准基因,而COI基因片段结合GenBank部分华溪蟹属序列数据分析,可区分本次研究所涉及的75%的物种。以线粒体COI基因片段为DNA条形码标准序列,可作为华溪蟹属淡水蟹类物种鉴定的辅助分类工具。     

泥蚶线粒体COI和16S rRNA基因片段序列研究

采用PCR技术扩增了泥蚶线粒体DNA的COI和16S rRNA基因片段,PCR产物经T载体连接后进行克隆、测序,用MEGA version 3.0软件计算这2个基因片段序列碱基组成.结果显示：COI和16S rRNA基因删除引物序列后分别得到660bp和548bp的核苷酸序列,T,C,A和G碱基含量分别为40.4%,14.7%,20.6%,24.3%和23.2%,25.9%,30.3%,20.6%.COI和16S rRNA基因片段对泥蚶不同地理种群的遗传分化的研究具有一定的应用价值.     

马尾松毛虫CPV基因组第7片段的cDNA克隆及序列分析

利用琼脂糖凝胶电泳分离马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)基因组dsRNA,并回收纯化第7片段(S7).经逆转录和PCR扩增,获得2个亚克隆片段并测序.再根据已测序列设计引物,利用RNA连接酶介导的RACE法得到S7两端克隆并测序.通过拼接可得到DpCPVS7全序列.经过序列分析发现,S7全长1502bp,5′端具有CPV 1型末端保守序列AGTAA,3′端具有保守序列GTTAGCC.起始密码子ATG位于25～27残基,终止密码子TAG位于1373～1375残基,推测S7片段编码448个氨基酸多肽,分子量约为5.0×107.与舞毒蛾质型多角体病毒(LdCPV 1)和家蚕质型多角体病毒(BmCPV)第7片段相比较,核苷酸同源性分别为99%和86%.     

稀有(鱼句)鲫(Rare gudgeon)Sox基因的克隆及序列分析

根据人的SRY基因中HMG-box保守区设计引物,采用PCR技术在稀有(鱼句)鲫雌雄个体基因组DNA中分别扩增,发现3个大小分别为220、700和1 500 bp的片段,经过克隆和测序分析,从220 bp的片段中获得两个基因片段,证明为稀有(鱼句)鲫的Sox1和Sox21基因片段,无性别差异,其DNA序列与人及斑马鱼相应Sox基因相似性分别为Sox1:80.4%和97%;Sox21:77.3%和91%,其编码的氨基酸序列与人及斑马鱼相应SOX蛋白相似性分别为Sox1:96%和98%;Sox21:88%和100%,显示了其高度的保守性.此外,从GenBank、MEBL和DDBJ数据库获得了92个已克隆的物种SRY和Sox基因全长核苷酸编码序列及HMG保守区序列数据.通过对这些数据进行序列比对及聚类树的构建,分析了Sox基因家族成员的分类及分子进化模式,对稀有(鱼句)鲫的性别决定进行了探讨,为Sox基因的进化研究提供分子基础.     

弯弓蚌螨(Unionicola arcuata)线粒体12 S rRNA基因的序列分析

用线粒体12 S rRNA基因特异性引物,对鄱阳湖地区褶纹冠蚌内弯弓蚌螨的线粒体12 S rRNA基因进行PCR扩增和双向测序,经校对拼接后,获得全长为648 bp的弯弓蚌螨12 S rRNA基因全序列。A、T、G、C 4种碱基的平均含量分别为49.1%、25.6%、8.5%、16.8%,平均A+T含量(74.7%)明显高于G+C     

池蝶蚌(Hyriopsis Schlegelii)线粒体DNA COII基因的序列分析

用细胞色素氧化酶Ⅱ基因特异性引物,对人工选育后的F3代池蝶蚌的线粒体细胞色素氧化酶Ⅱ基因进行PCR扩增和双向测序,在10个个体中均得到序列一致的细胞色素氧化酶Ⅱ基因序列,长度为681bp;A、T、G、C含量分别为19.4%(132个)、30.4%(207个)、38.9%(265个)和11.3%(77个),A+T含量(58.3%)明显高于G+C(41.7%)含量,与其它淡水珠蚌科种类相同基因片段的碱基含量相似;密码子上4种碱基使用出现偏倚性,密码子第1位上碱基G使用率高达38.8%,碱基T为29.5%;密码子第2位上碱基T的使用率为38.8%,碱基C的使用率低至15.9%;密码子第3位上碱基T的使用率高达48.5%,而碱基C的使用率仅为4%;第3位碱基T的使用率比第二位高,这种递增现象也出现在高等无脊椎动物昆虫的COⅡ上。BLAST结果显示池蝶蚌COⅡ与三角帆蚌具有较高的同源性,相似性为95%,MP法构建的分子系统进化树表明这两种淡水珍珠育珠蚌的亲缘关系最近。     

依据RAPD片段克隆而建立的团头鲂PCR鉴定法

通过对团头鲂RAPD片段的克隆、Southern杂交筛选和DNA序列分析,设计出3对PCR引物：M1F／M1R、M3F／M3R和M5F／M5R,这3对引物分别扩增出约1．00、1．15、0．56kb的DNA主带;HaeⅢ能将前两个片段酶民两个几乎相等或相似的小片段。经部分团头鲂群体和其它12种鱼DNAPCR验,除三角鲂外,这3对引物具有很强的团头鲂特羿性,重复性100％,可以用于除三角钫以外的团头鲂的分子标记或分子鉴定。     

人工选育F5代萍乡肉红鲫RAPD遗传分析

萍乡肉红鲫是分布于江西萍乡的具有地方特色的品种,经过人工选育获得了较为稳定的遗传特征。用经过筛选的23个随机引物对25个人工选育F5代萍乡肉红鲫基因组DNA进行RAPD分子标记。结果显示扩增片段大小在250 bp至2 100 bp,共扩增的条带数为229,差异标记条带大多数为弱带,多态位     

池蝶蚌金属硫蛋白基因的原核表达及活性分析

筛选池蝶蚌性腺转录组并运用RT-PCR方法扩增池蝶蚌金属硫蛋白(metallothionein,MT)ORF框序列。该序列有216个碱基组成,编码71个氨基酸,其中半胱氨酸含量丰富,富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys结构。多序列比对表明,池蝶蚌MT蛋白序列和其他物种MT序列有很高的同源性,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)MT蛋白具有100%的同源性。将该ORF框片段导入原核表达载体pET-32a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小约为27kDa,在25℃,终浓度为1mM IPTG诱导4h表达量最高,重组蛋白主要存在上清液中,纯化并获得了重组蛋白。细胞增殖实验表明,纯化的MT融合蛋白有生物活性并能有效地减轻宫颈癌Hela细胞的氧化胁迫效应。     

菊花EST-SSR标记的开发与应用

从NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库下载7 259条菊花相关表达序列标签(EST)序列,经去除冗余序列拼接后得到3 784条Uni-ESTs,总长度为2 088.6kb.用MISA软件查找其简单重复序列(SSR)位点,共获得407个SSR位点,分布于355条EST上,出现的频率为10.76%.在搜索到的EST-SSR中,三核苷酸重复类型占主导地位,所占比例为47.42%.共观察到76种重复基元,出现最多的重复基元是A/T和ACC/GGT,其次为ATC/ATG,AAC/GTT,AC/GT,AAT/ATT.根据搜索结果随机设计了24对菊花EST-SSR引物,对14个菊花品种进行PCR扩增,发现有12对引物有较清晰且稳定的扩增产物(其中10对引物的产物存在多态性),共检出37个位点(其中多态性位点32个),平均每对引物可扩增出3.2条多态性片段.遗传相似性分析显示,14个品种的遗传相似系数在0.61～0.84之间,平均相似系数为0.67.     

菜茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）cbn1和cao突变基因的对比分析及CAO基因的分子定位

用电击法将带有CAO基因片段的Psp109-E8质粒转入到莱茵衣藻cbnl-48mt^＋基因突变株中后．转化子中出现了叶绿素b的恢复性表达，初步验证了丧失合成叶绿素b能力的cbn1和cao突变基因具有等位性的属性；将1641-1b（cbn1-43mt^＋）和CC-1354（cbn1-48mt^＋）突变株分别与CBS5（cao5mt^-）突变株的分离子CBS5-c1和CBS5-c5进行杂交．并通过随机分析方法分离获得1842个减数分裂后代分离子．经检测其中均没有发现有野生性表型的分离子．初步证明cbn1和cao4突变基因问有着非常紧密的连锁性；从上述杂交系分离获得的50多个四分子中也没有检测发现显示野生性表型的分离子．进一步证明了cbn1和cao突变基因具有等位性的属性；根据CAO基因的DNA序列，从5＇-端和3’-端设计两个探针，分别与莱茵衣藻核基因组I号染色体上GBP1和RB47分子标记之间的21个BAC克隆进行的点杂交实验结果显示．该两个探针序列与21号BAC克隆（莱茵衣藻BAC文库序列号33e2）片段均有同源区的特性，此项DNA杂交实验初步证明．CAO基因的位点是在cbml突 变基因左右两侧的GBP1和RB47两个分子标记之间的33e2 BAC克隆片段区．     

稀有鮈鲫（Rare gudgeon）Sox基因的克隆及序列分析

根据人的SRY基因中HMG-box保守区设计引物，采用PCR技术在稀有鮈鲫雌雄个体基因组DNA中分别扩增，发现3个大小分别为220、700和1500bp的片段，经过克隆和测序分析，从220bp的片段中获得两个基因片段，证明为稀有鮈鲫的Sox1和Sox21基因片段，无性别差异，其DNA序列与人及斑马鱼相应Sox基因相似性分别为Sox1：80．4％和97％；Sox21：77．3％和9l％，其编码的氨基酸序列与人及斑马鱼相应SOX蛋白相似性分别为Sox：96％和98％；Sox21：88％和100％，显示了其高度的保守性．此外，从GenBank、MEBL和DDBJ数据库获得了92个已克降的物种SRY和Sox基因全长核苷酸编码序列及HMG保守区序列数据．通过对这些数据进行序列比对及策类树的构建，分析了Sox基因家族成员的分类及分子进化模式，对稀有鮈鲫的性别决定进行了探讨，为Sox基因的进化研究提供分子基础．     

几种饵料微藻基因组DNA的提取及其特异性引物的设计

用改良CTAB法提取我国沿海东南部滩涂贝类常见的4种饵料微藻的基因组DNA,结果发现提取的DNA产率高、完整性好,认为是一种简便而高效的微藻基因组DNA提取方法.对其18S rRNA 基因(18S rDNA)进行克隆与测序,并利用序列比对软件 MEGA 5.0对各微藻的18S rDNA序列进行两两比对,设计出了能够用于快速区分此4对饵料微藻的特异性PCR引物(Cha.F/Cha.R、Iso.F/Iso.R、Pla.F/Pla.R及Nan.F/Nan.R). PCR扩增验证实验结果显示,4对引物均具有很强的特异性,无交叉扩增现象.扩增片段大小范围为100~200 bp,满足实时荧光定量PCR的实验要求,在检测滩涂贝类对此4种饵料微藻的摄食选择性研究方面具有重要意义.     

假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法根据GenBank上登录的假结核耶尔森菌侵袭素蛋白核酸序列设计引物,用PCR方法扩增假结核耶尔森菌侵袭素蛋白基因,并将其插入克隆载体pMD18-T中,测序鉴定正确后再将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-inv.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测.结果假结核耶尔森菌提取的基因组,经PCR扩增,得到一段591 bp的片段,与预期结果一致;SDS-PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约46 kDa,与预期结果相同;重组菌体超声裂解后,经12%的SDS-PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为包涵体蛋白.结论克隆的侵袭素基因核心片段可以在原核细胞中高效表达.