固载化酶催化合成多肽的研究进展

评述了溶剂、载体性质与固载化方法、pH值、底物浓度以及反应温度等因素对固载化酶催化合成肽反应的影响,并概括了固载化酶催化合成生物活性肽、寡肽等方面的研究与应用.     

异辛醇中酶催化高效合成阿莫西林的研究

通过比较6种有机溶剂作为反应介质时对阿莫西林合成的影响,发现反应介质在保持酶的催化活性和稳定性方面发挥着非常重要的作用,确定异辛醇为酶催化合成阿莫西林的反应介质.通过研究不同温度下异辛醇中酶催化合成阿莫西林的时间曲线,确定了最佳反应温度和反应时间,通过对底物浓度和酶浓度进行响应面优化,最终得到阿莫西林合成的最优反应条件,在最优条件下可得到91.37%的最大阿莫西林产率.     

嗜热古细菌Sulfolobus tokodaii脱卤酶在D-乳酸生产中的应用

将来源于嗜热古菌Sulfolobus tokodaii的脱卤酶(L-HADST)基因克隆到载体p ET28b,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,在蛋白的N末端带有6个组氨酸融合标签,纯化后经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示融合蛋白的分子量约为25000.融合蛋白催化2-氯丙酸(2-CPA)的最适反应温度为70℃,最适p H值为9.5.以外消旋2-CPA为底物生产D-乳酸,利用HPLC检测反应液中2-CPA及乳酸的变化,发现L-HADST只催化L-2-CPA脱氯反应.对酶催化反应条件进行了优化,结果表明,在p H值为9.5,温度为60℃的条件下,当反应体系中缓冲液浓度为3 mol/L,底物浓度为0.5 mol/L,酶浓度为3×104U/L时有较高的底物转化率及乳酸生成量.依据条件优化结果可知,影响反应速度的因素有底物浓度、缓冲液浓度以及酶浓度,其中底物浓度变化对转换率的影响最明显.     

溴过氧化物酶催化环己烯环氧化反应

研究了分离自珊瑚藻(Corallina officinalis)的溴过氧化物酶在水-有机两相体系中催化环己烯环氧化的反应.考察了氧化剂种类与添加方式、pH、反应温度、酶浓度及KBr浓度等条件对环氧化反应的影响.最佳反应条件为:反应温度55℃,在含有50mmol/LKBr和32U/ml溴过氧化物酶的pH6.0的Tris-HCl缓冲液中,每隔10min补加50μl的2.29mol/LH2O2.在此反应条件下,环氧环己烷的收率达到41.5%,选择性为82.2%.     

固定化细胞酶法拆分N-乙酰-D,L-3-甲氧基丙氨酸

利用氨基酰化酶固定化细胞酶法拆分了N-乙酰-D,L-3-甲氧基丙氨酸. 考察了温度、pH值、底物浓度、金属离子和拆分时间对酶促反应的影响. 确定了氨基酰化酶固定化细胞手性拆分N-乙酰-D,L-3-甲氧基丙氨酸的最佳工艺条件为pH=7.0, 反应温度50 ℃及底物浓度500 mmol/L. 10^-4 mol/L的Co²⁺和Mg²⁺对氨基酰化酶有显著激活作用, Cu²⁺和Zn²⁺对酶促反应有明显抑制作用. 在最佳条件下, 氨基酰化酶固定化细胞对N-乙酰-L-3-甲氧基丙氨酸的摩尔转化率达96%.     

近平滑假丝酵母细胞催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应

 采用近平滑假丝酵母细胞用于催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应, 可高选择性地生成 (R)-1-三甲基硅乙醇. 结果表明, 固定化于海藻酸钙的细胞催化该反应的产物收率比游离细胞的高. 不同辅底物对该反应的影响显著, 以葡萄糖为辅底物时, 反应的初速率较快, 产物收率较高. 该反应的最适条件为: 辅底物 (葡萄糖) 浓度 110 mmol/L, 振荡速度 180 r/min, 缓冲液 pH 值 6.0, 反应温度 30 oC, 底物浓度 20 mmol/L. 在此反应条件下反应的初速率、产物收率和产物的 ee 值分别为 11.4 μmol/h, 96.5% 和 99.9%.     

青霉素酰化酶交联酶聚体的制备及热失活动力学

以0.53 g/mL硫酸铵为沉淀剂, 0.35%(体积分数)戊二醛为交联剂制得青霉素酰化酶交联酶聚体(CLEAs), 酶活收率30.1%, 其最适温度(57 ℃)比游离酶提高10 ℃, 最适pH(10.0)向碱性偏移1.7个单位. 对比游离酶及其CLEAs的热稳定性和热失活动力学模型发现, 游离青霉素酰化酶制成CLEAs后, 其热失活动力学模型由一步失活转变为连串失活, 失活反应活化能由248.8 kJ/mol增加至549.2 kJ/mol, 对CLEAs热稳定性大幅提高的原因进行了解释. CLEAs重复利用7次后, 酶活保留56%以上, 具有良好的重复利用性.     

棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶Ⅰ在毕赤酵母中的表达及烷基糖苷的催化合成

将来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus NO. F-50)的β-葡萄糖苷酶Ⅰ在毕赤酵母中分泌表达. 初步研究表明, 目的蛋白得到较好表达, 以对硝基酚-β-D-葡萄糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside, pNPG)为底物, 重组β-葡萄糖苷酶Ⅰ酶促反应的最适温度为65 ℃, 最适pH为5.0, 50 ℃下反应发酵上清液中的酶活力可达33.8 U/mL, 蛋白表达量最高可达0.388 mg/mL. 该重组酶可通过逆水解或转糖苷反应催化合成烷基糖苷. 在有机-水双相反应体系中, 初步优化了pH 值、 含水量、 葡萄糖浓度及酶量等条件. 结果表明, 在优化的反应条件下, 丁基、 己基、 辛基和癸基葡萄糖苷最大产率分别为51.4%, 28.8%, 6.9%和3.0%.     

腈水合酶的发酵及酶学性质

红球菌Rhodococceus rhodochrous J1在含有脲和钴的培养基中发酵产生腈水合酶，可以催化丙烯腈水合为丙烯酰胺。调节培养条件使发酵液的酶活力达到6150u／ml。温度30℃，反应体系呈中性酶活性很高并且稳定。底物浓度，酶浓度，反应时间的正交实验表明，底物丙烯腈是显著因子，最佳浓度7％，超过此浓度酶会失活；1min内，水合反应转化率可达80％。浓度超过15％的丙烯酰胺会抑制酶的活性。     

壳聚糖固定化乳酸脱氢酶的制备及酶学性质研究

以磁性壳聚糖作为载体,戊二醛作为交联剂,对乳酸脱氢酶(LDH)进行固定化.固定化的最适条件为:戊二醛浓度6%,pH值7.5,酶的偶联时间2 h.对游离及固定化LDH酶学性质的研究表明,酶促反应的最适pH值为9.2,最适温度分别为37℃和50℃,对乳酸的表观米氏常数分别为1.6 mmol/L和0.9 mmol/L.游离酶和固定化酶在40℃放置150 min后,其活力分别为最初的56.5%和76.1%.固定化酶在4℃贮存4周后,活力仍保留50%以上.固定化酶在室温下与底物重复反应6次后,活力仍保留60%以上,说明固定化酶具有较好的热稳定性、贮存稳定性和复用性.     

磁性聚合物微球固定化青霉素G酰化酶制备光学纯(S)-2-氯苯甘氨酸

通过反相悬浮聚合法制备了超顺磁性环氧聚合物微球用于固定化青霉素G酰化酶,利用磁性固定化酶催化N-苯乙酰-(R,S)-2-氯苯甘氨酸进行不对称水解反应,制备出(S)-2-氯苯甘氨酸单一对映体。磁性固定化酶催化水解反应的适宜条件为:底物浓度100 mg·m L-1,反应温度和时间30℃和12 h,反应溶液p H 8.0。在此条件下,N-苯乙酰-(R,S)-2-氯苯甘氨酸的转化率为48.8%,产物(S)-2-氯苯甘氨酸的对映体过量值eep达99.4%。磁场下回收磁性固定化青霉素G酰化酶,重复使用6次,底物的转化率和产物的对映体过量值分别为47.8%和91.4%。     

脂肪酶催化扁桃酸乙酯酯交换反应的研究

利用脂肪酶Novozym 435在正丁醇体系中催化酯交换反应,对(R,S)-扁桃酸乙酯进行了动力学拆分,考察了系统初始加水量,反应温度,振荡速度,底物浓度等因素对脂肪酶催化活性和对映体选择性的影响.研究结果表明,最适初始加水量为0.4%;在20℃~60℃范围内,酶催化活性随温度升高而增加,酶选择性随温度先升高后下降,最适温度45℃;底物扁桃酸乙酯浓度达5000 mmol/L时,未观察到底物抑制现象,反应初速度为2.78mmol.L-1.m in-1.     

贝壳状革耳菌漆酶酶活测定方法分析

酶活测定方法中所用的反应底物、反应条件以及酶活单位定义对漆酶酶活的测定结果有很大的影响。在对贝壳状革耳菌 (Panusconchatus)漆酶酶活测定方法的研究中发现 ,该酶与 2 ,2’ -连氮 -双 ( 3-乙基并噻- 6 -磺酸 ) (ABTS)反应的最适pH值为 3.0 ,而与紫丁香醛连氮、2 ,6-二甲氧基苯酚和邻甲联苯胺反应的最适pH值均为 4.0。上述底物与Panusconchatus漆酶反应的Km (米氏常数 )分别为 0 .0 1 1 6(mmol·L) - 1 ,1 4.1 0 95 (mmol·L) - 1 ,0 .1 0 1 1 (mmol·L) - 1 ,0 .1 41 5 (mmol·L) - 1 。该酶与ABTS、2 ,6-二甲氧基苯酚和邻甲联苯胺反应均表现为零级反应 ,而与紫丁香醛连氮反应时只在一定范围的酶浓度以及反应时间内才表现为零级反应。     

水／离子液体两相体系中出芽短梗霉催化4-氯-乙酰乙酸乙酯不对称还原合成（S）-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯

考察了水/离子液体两相体系中出芽短梗霉(Aureobasidium pullulansCGMCC1244)催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不对称还原生成光学活性(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)的性能,并对反应条件如摇床转速、相体积比、温度、初始底物浓度和pH值等进行了优化.结果表明,在水/1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐体系中,出芽短梗霉催化COBE不对称还原生成(S)-CHBE,在30℃,pH6·6,摇床转速180r/min和不对称反应8h条件下,反应物的转化率、产物ee值和浓度分别达到95·6%,98·5%和47·1g/L.在控制pH值为6·6的情况下,通过分添加底物可有效提高产物(S)-CHBE浓度至75·1g/L.     

酶法拆分D,L-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸

在固定化青霉素酰化酶(IPA-750)存在下,通过N-苯乙酰-D,L-苯丙氨酸(2)的选择性水解完成了酶法拆分D,L-苯丙氨酸(1)制备D-苯丙氨酸(5)的过程。选择性水解的较适宜反应条件为:22.83g,m(2)∶m(IPA-750)=6∶1,pH7.0,于30℃反应5h,产物为N-苯乙酰-D-苯丙氨酸(4)和L-苯丙氨酸(3,收率63%,光学纯度99%)。4用6mol·L-1盐酸于120℃水解反应8h,经脱盐处理得5,收率67%,光学纯度91%。3在含醋酸酐的醋酸溶液中进行消旋化处理,得到100%消旋的1可继续进行下一轮酶法拆分。     

醇脱氢酶在反胶束溶液中的酶学性质研究

以十六烷基三甲基溴化铵(CATB)-辛烷-戊醇反胶束体系对醇脱氢酶(ADH)进行固定化,考察了pH、含水量、表面活性剂和助溶剂浓度对ADH固定化的影响。对游离酶和固定化酶的催化动力学性质研究表明:酶促反应的最适pH值均为9.0,最适温度分别是28℃和20℃,对乙醇的米氏常数分别为8.8mmol/L和5.5mmol/L。25℃时,游离酶存放120min约失活90%,而固定化酶仅失活30%,表明反胶束固定化ADH具有较好的热稳定性。     

棕榈酸维生素C酯的酶催化合成

以棕榈酸甲酯和维生素C为原料,以脂肪酶(LIPOZYM IM)为催化剂,催化合成了棕榈酸维生素C酯.详细研究了几种因素(维生素C与棕榈酸甲酯的摩尔比,反应温度,反应时间及脂肪酶用量)对合成反应的影响,确立了棕榈酸维生素C酯的较佳合成条件底物摩尔比为31,反应温度55℃,反应时间8h,脂肪酶用量为反应体系的3%(重量),产品一次收率为68.2%.     

有机溶剂中(R)-醇腈酶催化不对称合成(R)-苯乙醇腈

 研究了来源于杏仁的（R）－醇腈酶在有机溶剂异丙醚中催化苯甲醛与HCN不对称合成（R）－苯乙醇腈，初步探讨了来源于不同杏仁的（R）－醇腈酶的筛选、最适酶量的确定以及底物HCN与苯甲醛的配比、底物浓度、酶的微环境pH和反应温度对不对称合成反应的影响．结果发现，来源于苦杏仁的（R）－醇腈酶优于来源于甜杏仁的（R）－醇腈酶．优化的反应条件为：最适酶量150g／L，HCN与苯甲醛的配比2．5，苯甲醛浓度300mmol／L，酶的微环境pH5．4，反应温度0～5℃．在该优化反应条件下，反应平衡转化率和产物的光学纯度均高达99％以上．     

醇脱氢酶在反胶束溶液中的催化动力学性质

以十六烷基三甲基溴化铵(CATB)-辛烷-己醇反胶束体系对醇脱氢酶(ADH)进行固定化,试验了含水量、酶液pH值、CTAB和己醇浓度对ADH固定化的影响。对游离酶和固定化酶的催化动力学性质研究表明：酶促反应的最适pH值分别为8.2和8.8,最适温度分别是31℃和20℃,对乙醇的米氏常数Km分别为12mmol/L和7.4mmol/L。在30℃时,游离酶存放150min后失活90%,固定化酶失活50%,表明反胶束固定化ADH有较好的热稳定性。     

表面活性剂在水-有机两相体系中对β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷的影响

采用缓冲液/正己烷为反应体系,比较了几类表面活性剂(CTAB,SDS,SDBS,Tween 20)对酶活的影响.并在该反应体系中,考察了表面活性剂对β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷的反应中底物转化率以及初始反应速率的影响,确定了反应混合体系的适宜含水量.结果表明,在水/有机两相体系中,HLB值较高的SDS对酶的失活体现出了一定的抑制作用,其余表面活性剂均对酶失活起了不同程度的加速作用.在几类表面活性剂各自最适添加浓度下,CTAB,SDS,Tween 20三组均将底物转化率从9.2%提高到11%左右.不添加表面活性剂所测得的初始反应速率最高,Tween 20组次之,离子型表面活性剂添加组最低.对于SDS添加组,当其含水量为10%时,底物转化率可以达到22.3%.