二维液相色谱接口技术

二维液相色谱具有峰容量大、分辨率高、分析速度快等优点,已经成为复杂样品分离分析的重要工具。两种分离模式的转换通常需要经过一个特殊接口来完成,接口是二维液相色谱系统的核心,也是限制二维液相色谱应用的瓶颈;两种流动相不互溶时,接口尤为重要。本文针对二维液相色谱接口技术近期的发展和应用进行总结。引用文献51篇。     

二维液相色谱接口的改进及其在蛋白质组学研究中的应用

随着蛋白质组学、本草物质组学等组学概念的提出,所需分析的样品的成分越来越复杂,因此具有强大分离能力的多维液相色谱技术受到人们越来越多的关注。二维液相色谱中第二维的分离性能和速度是整个分离系统性能的关键。基于捕集柱模式,我们采用经特殊设计的流路系统,使得双捕集柱型接口具有预分离的功能。样品从第一维流出以后被富集在捕集柱1的柱头,经过脱盐后,正冲捕集柱,捕集柱1与第二维色谱柱联用对富集的样品进行分离,增加了第二维分离效率。当捕集柱上的样品全部被洗脱到第二维色谱柱上时,捕集柱2已经完成对第一维洗脱液中样品的捕集和脱盐,此时将阀进行切换,捕集柱2与第二维色谱柱直接相连进行洗脱。循环切换捕集柱1和捕集柱2,维持较高的阀切换频率,实现了第二维色谱柱的连续洗脱。因此保证了第二维分离具有较快速度,同时具有较高的分离效率。使用35 mm长捕集柱和十通阀为接口,以弱阴离子交换(WAX)色谱为第一维分离模式,以反相(RP)色谱为第二维分离模式,构建了WAX-RP二维液相色谱系统(2D-LC system)。以小鼠血清为样品对系统进行了初步评价。色谱流出曲线出现了明显的界面现象,这是由于捕集柱流动相中含有的较多盐分流出时的背景吸收造成的。同时,由于界面两侧的流动相黏度不同产生了黏性指进(VF)现象。当第二维色谱柱长度为50 mm时,理论上可将第二维分离效能提高70%。该接口可以应用于多种二维液相色谱模式,适用于蛋白质组学和本草物质组学研究中对于复杂样品的分离分析。     

高温正相色谱/反相色谱(HTNPLC/RPLC)二维联用系统的构建与应用

为解决含水正相色谱与反相色谱联用过程中的谱带展宽问题,以高温正相色谱(HTNPLC)为第一维,室温反相色谱(RPLC)为第二维,分别建立了切割模式的二维液相色谱(HTNPLC-μRPLC)和全二维液相色谱(HTNPLC×RPLC)系统.样品首先在第一维(CN色谱柱)进行正相分离,第一维洗脱产物选择性地或者交替存储在十通阀上的定量环中,然后切换十通阀将定量环内存储的样品组分转移到第二维(C18色谱柱)进行反相分离.该系统降低了第一维切割组分在第二维柱头的扩散,提高了分离度以及分离效率.采用多环芳烃混合物和天然植物甘草提取液对该二维液相色谱系统进行了评价.     

色谱最新研究亮点

1 多维分离技术新进展 一维色谱是目前最常用的分离分析方法,然而对于复杂体系如蛋白质组,采用一维分离模式其分离度远远不能满足要求.Giddings理论告诉我们:对于分离机理相互正交的二维分离系统(如色谱),峰的容量应该为两个色谱柱峰容量的乘积.因此,多维分离系统是解决复杂分离体系的一个最佳选择.在多维色谱中二维气相色谱发展较快,目前全二维气相色谱仪业已商品化,其峰的容量达到104以上.而二维液相色谱,尤其是正相/反相二维液相色谱技术发展较为缓慢,其主要的技术瓶颈在于第一维色谱(正相)分离后的流动相严重干扰第二维色谱(反相)的分离.     

多维液相柱色谱

多维液相柱色谱分离分析复杂样品越来越受到重视。本文介绍了国内外多维液相柱色谱的近期发展,详细讨论了二维液相色谱的实现,其中包括固定相、流动相的选择、温度变量的作用以及两维间切换的实现,并对多维液相柱色谱的应用现状进行了总结。     

全二维液相色谱(IEC/RP)的构建与评价

以IEC/RP模式构建了二维液相色谱系统,采用平行交替柱捕集分析的2位十通切换阀作接口,第一维洗脱产物按10:1的分流比分流后,得到IEC和RP切换谱图.以5个标准蛋白混合物的分离评价该系统,在单独一维模式中不能分离的样品在全二维液相色谱中得到了很好的分离.     

HPLC柱切换技术在临床药物分析中的应用

综述了近十年来高效液相色谱柱切换技术在药物分析中的应用情况，主要介绍了柱切换技术在生物样品纯化，富集和手性分离方面的实际应用，该技术可用于直接进样分析，特别适用于临床药物分析，可和于药代动力学，生物利用度等研究。     

全二维液相色谱的初步构建及其在山羊血清分离中的应用

以GFC/RP模式构建全二维液相色谱系统,第一维凝胶过滤色谱柱使用ShodexProteinKW 802. 5(300mm×8mmi.d. ),以0. 2mol/LNaH2PO4 (pH7. 0)的流动相在0. 15mL/min的流速下等度洗脱,第二维反相色谱柱使用HypersilBDSC18 (35mm×4. 6mmi.d. ),在3mL/min的流速下梯度洗脱。采用平行柱交替分析的形式作切换接口, 2. 5min切换一次,两个反相柱交替富集、分析第一维洗脱产物。以5个标准蛋白混合物的分离评价该系统,在单独一维模式中不能分离的样品在全二维液相色谱中得到了较好的分离,二维系统的总峰容量为225。与一维色谱相比,系统的总峰容量、分辨率得到较大提高。并用于山羊血清的纯化分析,对一维分离中的重合谱峰进行验证,对制备纯化有一定的实际意义。     

高温二维液相色谱系统的构建及其评价

在二维液相色谱中, 第二维的分离速度是制约其发展的重要因素. 升高色谱柱温度可以有效降低流动相粘度, 加快溶质在两相间的传质速率, 有效加快分析速度. 以离子交换色谱法(WAX)为第一维分离模式和反相色谱法(RP)为第二维分离模式, 十通阀和两个捕集柱为接口, 通过将第二维色谱柱温度升高到80 ℃和提高流量到3 mL/min, 构建了高温WAX/RP二维液相色谱系统. 以4种标准蛋白的酶解物为样品评价系统的分离性能, 第一维共有33个馏分被捕集并导入到第二维分析, 高温二维液相色谱系统识别出187个色谱峰.     

二维高效液相色谱技术用于分析中药制剂中麻黄类生物碱

构建了一个离线的二维高效液相色谱系统,以解决成分复杂的中药样品的分离和痕量组分的定量问题。该系统在原有的单泵、单检测器高效液相色谱仪的基础上作了相应的改进而构成,样品先在第一维的Zor-bax SB-C18色谱柱中进行分离之后,利用一个六通切换阀将目标组分切换并收集,浓缩后再注入第二维的Ai-chrom Bond-AQ C18色谱柱中进行分离。利用上述方法对3种麻黄类生物碱进行了二维分离和分析,实验结果表明,样品的分离明显改善,并且这个系统可用于中药的直接进样分析。     

二维液相色谱(SCX/RP)系统的构建及对珠蛋白水解产物的研究

以十通阀为切换接口, 构建了SCX/RP常规柱二维液相色谱系统, 并以珠蛋白水解产物的分析对其加以评价. 样品首先由第一维阳离子交换色谱(Hypersil SCX, 100 mm×4.6 mm I.D.)在pH 4.0的磷酸盐缓冲体系中分离, 洗脱产物进入切换接口, 样品组分被富集在捕集柱(Hypersil BDS C18, 15 mm×4.6 mm I.D.)中, 进一步脱盐后被导入第二维反相色谱(Hypersil BDS C18, 250 mm×4.6 mm I.D.)分离分析. 阳离子交换色谱采用逐步增加盐浓度的12步台阶等度间断方式洗脱, 每次将洗脱产物捕集在捕集柱中进而由反相色谱分析, 实现对第一维洗脱产物的切割转移及第二维分析. 与一维色谱相比, 二维液相色谱系统的分辨率、峰容量也得到提高, 系统峰容量达到2280.     

NEWS

高效液相色谱的应用范围十分广泛,约有80％的有机物均可使用高效液相色谱进行分析。近年来其发展颇为迅猛,功能不断完善。2006年获得匹兹堡金奖产品的赛默飞UltiMate 3000 DGLC双三元液相色谱,便是杰出的代表。其采用独特的双泵设计,每个泵作为一个单独的体系,有各自独立的比例阀和流动相体系,同时单独控制三种不同的流动相,在Chromeleon变色龙软件的支持下,结合独特的阀切换技术,通过灵活的流路连接设计,一套系统即可以轻松实现在线固相萃取、中心切割及全二维液相色谱分离、流动相在线除盐、柱后衍生和反梯度补偿、并联/串联色谱等高级应用。本刊中有多篇文章利用UltiMate 3000 DGLC双三元液相色谱的在线固相萃取( online SPE)技术和二维及全二维液相色谱分离技术,解决了他们遇到的复杂难题。     

基于液滴微流控接口的高效液相色谱-毛细管电泳二维分离平台初探

蛋白质组体系的高度复杂性需要更高分辨率的多维分离技术。近年兴起的液滴技术在微纳尺度样品操控方面具有微体积、低扩散、无返混等独特优势,有望为多维分离平台的接口提供解决方案。通过采用不同结构的液滴微流控芯片可以实现“液滴生成”与“油相排除”功能,进行样品由连续流-非连续流-连续流的高效转移,将不同的分离模式进行二维耦联。本研究利用液滴作为接口技术耦联高效液相色谱与毛细管电泳构建二维分离系统,以蛋白质降解的复杂多肽混合物为样品,考察了液滴接口二维分离平台的可行性和有效性,并获得3000以上的峰容量,初步展示了该接口技术在多维分离分析领域的应用潜力。     

二维液相色谱-质谱联用分离中药复方葛根芩连汤中的有效成分

建立了二维液相色谱-质谱联用方法分离中药复方葛根芩连汤的成分。以CN柱作第一维色谱柱,水和甲醇梯度洗脱分离;以ODS柱作第二维色谱柱,20 mmol/L乙酸铵缓冲液和乙腈梯度洗脱分离;质谱检测采用电喷雾电离/大气压化学电离（ESI/APCI）复合离子源,正负离子扫描。实验结果表明搭建的二维液相色谱的峰容量显著高于一维色谱,分离效率得到了明显的提高。以第一维色谱的第3个流分为例,对其二维分离进行仔细分析,发现质谱比紫外光谱检测到的组分多,质谱中采用负离子模式比正离子模式检测到的组分多。表明搭建的二维液相色谱-质谱分离平台分离效果好,提高了液相色谱的峰容量和分离效率。该方法操作简便,可作为中药等复杂体系分离分析的有效手段。     

一种用於柱上在线富集的高效液相色谱柱头设计

在高效液相色谱基础上,利用阀切换技术,将经过初次分离(或柱上富集)的全部或部分样品选择性地切换到另一些色谱柱上再次进行分离的多维(多柱)高效液相色谱(HPLC),是近几年来迅速发展起来的一种分离技术。由于它具有选择性强、灵敏度高、操作简便和便于自动化等特点,各种多维HPLC形式(GPC-/RP-HPLC、正相-/RP-HPLC,RP-/RP-HPLC)竞相出现,大大扩展了HPLC的应用范围。     

全二维气相色谱技术及其进展

 许多分析问题的解决需要得到比一维色谱技术能提供的更高的分辨率。分离能力可通过使用多种分离技术或机理的组合来增强。此时 ,样品被分散在不同的时间维 ,最终的分辨率强烈地依赖于这些维间分离特性的差异。当它们之间没有关联 ,也即相互间正交时 ,系统可获得最高的分辨率。全二维气相色谱 (GC×GC)提供了一个真正的正交分离系统。它把分离机理不同而又互相独立的两支色谱柱以串联方式结合组成二维气相色谱。在这两支色谱柱之间装有的一个调制器起捕集再传送的作用。全二维色谱的峰容量为组成它的两支色谱柱各自峰容量的乘积。     

基于双回路技术的二维色谱在线/离线接口设计与评价

双回路技术是一套机械传动组件和流路系统,具有自动进样和馏分收集的双重功能。本研究基于双回路技术设计了一种二维液相色谱在线/离线接口,用以有效连接两种不同分离模式构建分离系统,提高系统峰容量,并对其功能进行了评价。以4种芳香族化合物为分离对象,利用设计的接口连接1套液相色谱系统,实现了进样、馏分收集、再进样纯度分析的多重操作集成;连接2套液相色谱系统,采用强阳离子交换模式对5种蛋白质样品进行初步分离,收集难分离组分,并通过再次进样到反相色谱模式的分离系统中,组分得到良好分离。进一步基于此接口连接1套强阳离子交换系统和1套微柱反相色谱系统,对牛血清白蛋白酶解产物进行在线二维分离,以1 m AU为积分阈值,共识别292个色谱峰。新型在线/离线接口可灵活实现样品微量制备、难分离组分的精细拆分和复杂样品的二维分离,为二维色谱系统的构建及分离研究提供了有力工具。     

离线二维液相色谱法分离巴天酸模根的化学成分

建立了离线二维反相/反相液相色谱分离体系（2D-RPLC/RPLC）,对巴天酸模中的化学成分进行分离。通过比较巴天酸模乙酸乙酯萃取液在环氧四氮唑和Unitary C18色谱柱上的高效液相色谱图,确定以环氧四氮唑色谱柱为第一维色谱柱,以Unitary C18色谱柱为第二维色谱柱。流动相均采用0.1%（v/v）甲酸水溶液和甲醇,梯度洗脱。经一维色谱分离后,共收集18个流分,采用二维色谱对这18个流分进行了进一步的分离分析。实验结果表明,该二维色谱分离方法高效、可行,为巴天酸模药材的微量组分的分离以及活性化合物的筛选提供了分离方法。     

用于人血浆中蛋白质分离的在线阵列式二维常规柱液相色谱系统的建立

构建了一种在线阵列式二维常规柱液相色谱系统,并将其应用于分离血浆中的完整蛋白质。该系统以1根强阴离子交换柱作为第一维分离柱,8根阵列式反相色谱柱作为第二维分离柱。强阴离子交换柱分离的馏分通过十通阀被依次转移到第二维预柱上并得到保留富集,随后第二维流动相通过分流器同时将预柱上的蛋白质反冲至分析柱上进行分离。二维之间以及第二维阵列色谱柱之间均相互独立,从而可以提高系统分离的通量和总峰容量。采用该系统对血浆中的蛋白质进行了完整蛋白质水平上的分离。该系统具有高通量和高分辨率的特点,为血浆样品中高丰度蛋白质的去除以及血浆样品的深入研究提供了一种有效的手段。     

在线二维液相色谱技术在中药研究中的应用进展

中药的组成复杂,其化学成分的表征和识别一直是中药研究的基础和关键。在线二维液相色谱是基于两种分离模式构建的色谱分析技术,主要包括中心切割二维液相色谱和全二维液相色谱两种模式,因二者具有更高的峰容量而在中药研究中备受青睐。该文对在线二维液相色谱技术的概念和特点进行了讨论,并对二维液相色谱在中药研究中的应用进行了综述,以期为该技术在中药质量控制、物质基础表征、活性成分筛选等研究方面提供一定参考。