环境激素邻苯二甲酸二丁酯免疫检测Ⅱ——抗体的制备

邻苯二甲酸二丁酯(DBP)半抗原衍生物通过偶氮键与载体蛋白BSA偶合后作为免疫原,免疫新西兰大白兔,得到合格的DBP抗血清,双向琼脂扩散方法测定血清效价为1∶32～1∶64,间接荧光免疫法检测效价为1∶6 400～1∶12 800。通过兔颈部采血、抗血清纯化,得到的抗邻苯二甲酸二丁酯多克隆抗体IgG冻干后,分装在-20℃低温保存。建立了间接荧光免疫法检测纯化抗体的方法。间接竞争荧光免疫法考察交叉反应试验结果显示,纯化抗邻苯二甲酸二丁酯抗体与邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丙酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二戊酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯等邻苯二甲酸酯类环境激素的交叉反应均小于10%。制备的抗体可应用于环境激素DBP的荧光免疫分析。     

粘着斑激酶的原核表达、纯化及抗体的制备

粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是细胞质内单亚基非受体型酪氨酸激酶,通过各种信号途径参与调节细胞生长、发育、黏附、细胞骨架重组、转化、扩散和迁移等过程.采用PCR方法,从Flag-FAK质粒中克隆编码FAK C端273个氨基酸的基因片段,构建FAK融合蛋白原核表达载体pET28a( )/FAK,进行原核表达与蛋白纯化,取纯化的FAK蛋白免疫小鼠,制备FAK抗血清.结果表明构建的表达FAK C端功能结构域的原核表达质粒pET28a( )/FAK,经过BL21(DE3)大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,获得相对分子质量约33 kDa的融合蛋白,并利用小鼠制备了多克隆抗体,EL ISA检测显示该抗体有较高效价.荧光免疫结果显示此多克隆抗体与FAK蛋白特异性结合,为进一步研究神经细胞中FAK的作用机制奠定了基础.     

低分子量紫色酸性磷酸酶多克隆抗体的制备及应用

将最近从地瓜中提出来的低分子量紫色酸性磷酸酶（smPAP)基因克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX－2T中，在大肠杆菌BL21codon plus中进行表达，用表达的融合蛋白免疫兔子产生多克隆抗体，用抗血清在昆虫细胞中表达的smPAP和地瓜提取液中分离纯化的PAP进行检测，产生了良好的交叉反应。     

一种检测二恶英的单链抗体方法

本发明公开了一种检测二恶英的单链抗体方法。该单链抗体基因来源于小鼠，克隆到表达载体pET20b，在大肠杆菌BL21中表达，利用表达蛋白上带有的His-tag标记可通过亲和层析纯化单链抗体蛋白，并利用C-myc标记检测单链抗体蛋白。本发明克隆到鼠源的抗二恶英类化学物质的单链抗体，该抗体能应用于检测二恶英类化学物质，检测成本低，应用前景广泛。     

一种新的混合斑精子分离方法

制备了精子表面膜抗原受精素β蛋白(Fertilinβ)的特异性抗体,通过抗原-抗体反应和抗体固相偶联技术,将抗体连接到琼脂糖球珠上,建立了混合斑精子分离纯化的新方法.首先,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码人受精素β蛋白第341~373位氨基酸的基因序列,构建PGEX-4T-1/Fertilinβ原核表达质粒;其次,诱导表达GST-Fertilinβ融合蛋白,制备受精素β蛋白多克隆抗体,免疫荧光检测结果表明,受精素β蛋白定位于精子的头后部,并且阴道上皮细胞没有受精素β蛋白的表达;最后,将受精素β抗体与ProteinA琼脂糖球珠连接构建固相抗体系统,将精子吸附于表面,可从混合斑(精子与阴道上皮细胞混合液)中分离纯化精子.本文为性犯罪案件侦破提供了新的方法.     

酶联免疫法检测新型除草剂双甲胺草磷

以甲醇与三氯硫磷为原料,人工合成了半抗原结构类似物,与琥珀酸酣反应引入羧基,利用活性酯法使之与载体蛋白偶联,制得完全抗原,免疫动物获得多克隆抗体,建立了新型除草剂双甲胺草磷(H-9201)的间接竞争ELISA检测方法,并进行了水体中除草剂H-9201残留的实际样品检测.结果表明:所获得的多克隆抗体可以特异性的识别目标化...     

中药致肾毒性成分马兜铃酸A单抗制备及酶联免疫分析方法的建立

采用活化酯法,将马兜铃酸A分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,得到免疫抗原马兜铃酸A-BSA和包被抗原马兜铃酸A-OVA.利用马兜铃酸A-BSA免疫Bal b/c小鼠,制得鼠单克隆抗体1A11,单抗效价为2×104;单抗为IgG1类,轻链为κ型;与其结构类似物马兜铃酸B、C和D的交叉反应率分别为2.8%,3.5%和31.2%.基于抗马兜铃酸A单克隆抗体的间接竞争酶联免疫分析方法(icELISA)的IC50为1.9 μg/L,检测范围为0.5～7.5 μg/L.icELISA添加回收率为86%～97%,相对标准偏差在5.2%～11.1%之间.利用所建立的icELISA测定了6个中药材和5个中成药中马兜铃酸A的含量,并用高效液相色谱法(HPLC)进行了验证,其中关木通、广防己、天仙藤、马兜铃和青木香中均检测出马兜铃酸A,而川木通和5个中成药中未检测到马兜铃酸A.结果表明: 本方法可用于中药中马兜铃酸A的快速检测.     

滴滴涕单克隆抗体的制备及其评价

以滴滴涕(DDT)的特征部分为基础设计并合成了半抗原4-{4-[2,2,2-三氯-1-(4-氯-苯基)-乙基]-苯基}-丁酸(DDT-H1)、4-[4-(2,2,2-三氯-1-对甲苯基-乙基)-苯基]-丁酸(DDT-H2),并采用活泼酯法制备免疫原DDT-H1-BSA,以及混合酸酐法制备包被原DDT-H1-OVA、DDT-H2-OVA;用DDT-H1-BSA对小鼠进行免疫,通过细胞融合、筛选、克隆等步骤得到1株能稳定分泌DDT农药抗体的单克隆细胞株。细胞株经扩大培养后,注射小鼠体内产生腹水,并将其用辛酸-硫酸铵和protein A柱子纯化出单克隆抗体。其分泌的单克隆抗体免疫球蛋白亚类为Ig G1,单抗腹水的效价为1.68×105,亲和力Ka为5.238×1011L·mol-1,与其它几种代谢物有一定的交叉反应。在此基础上,利用获得的单抗研究建立DDT的间接竞争酶联免疫吸附检测法(ic ELISA)。结果表明,所建立的间接竞争ELISA方法的线性范围(IC20~IC80)为6.6~521.8 ng/m L,可用于检测农副产品、环境中残留的DDT及其代谢物。     

新城疫病毒流式微球免疫检测新方法

本研究基于新城疫病毒多克隆抗体的制备及优化,以聚苯乙烯微球作为蛋白质载体建立免疫检测体系,建立了快速检测新城疫病毒的流式细胞术新方法。以藻红蛋白荧光染料对新城疫多克隆抗体荧光标记,取1μL荧光微球与100μL新配制的单克隆抗体溶液反应,依次加入一定量待测抗原和藻红蛋白标记的多克隆抗体,漩涡振荡10s,室温振荡反应充分,形成双抗体夹心复合物,用流式细胞仪进行检测。采用ELISA法对免疫试剂进行了匹配性筛选实验,优选了试剂用量,并与传统ELISA方法进行了对比分析。实验结果表明,单克隆抗体350mg/L、多克隆抗体300mg/L时可获得最佳分析效果,与传统的ELISA方法呈现出良好的相关性,不与鸡传染性支气管炎病毒、鸡痘病毒、鸡马立克氏病病毒等发生交叉反应。     

环境荷尔蒙类物质2,4,6-三氯酚人工抗原的合成

以环境荷尔蒙类物质2,4,6-三氯酚(TCP),氯乙酸为起始原料,经2步反应合成了2,4,6-三氯苯氧乙酸(1)。通过混合酸酐法将1分别与载体蛋白质BSA,OVA偶联获得了TCP的免疫抗原(TCP-BSA)和包被抗原(TCP-OVA)。TCP-BSA免疫兔获得了具有较高效价的抗TCP的多克隆抗体。     

Preparation and Characterization of Olaquindox Polyclonal Antibody

本研究先将喹乙醇琥珀酸单酯化,使其转变为带有羧基的衍生物。合成产物经重结晶纯化,得率为52.47%。合成产物进行结构鉴定,合成了具有喹乙醇分子结构特征的喹乙醇半抗原。采用活化酯法将半抗原与牛血清白蛋白（BSA）进行偶联,采用混合酸酐法将半抗原与卵清蛋白（OVA）进行偶联,分别制备免疫原和包被抗原。紫外扫描与红外图谱分析结果表明,半抗原与载体蛋白偶联成功,与BSA、OVA的结合比分别为3.8:1和5.0:1。以OLA-BSA作为免疫原免疫4只新西兰大白兔,获得了较高效价的抗血清,以OLA-OVA作为包被抗原,间接ELISA法测定各兔的效价,分别为1:6400;1:1600;1:12800;1:6400。间接ELISA法喹乙醇的抑制中浓度IC50为743.3 ng/mL,最低检测限IC20为5.71 ng/mL。从电泳图谱分析可以看出,经纯化得到了纯度较高的喹乙醇多克隆抗体,为喹乙醇免疫分析方法的进一步研制和开发奠定基础。     

二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药单链抗体的制备及广谱特异性

从分泌抗二乙氧基硫代磷酸酯类有机磷农药(DPPs)单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞系(12C2)中提取了总RNA, 经RT-PCR反转录成cDNA, 设计带linker引物, 采用重叠延伸PCR制备单链抗体(scFv)基因, 将其克隆到噬菌体载体p3MH中, 构建成噬菌体单链抗体表达载体, 转化大肠杆菌表达出噬菌体表面展示scFv, 对经过Phage-ELISA鉴定的阳性克隆进行噬菌体外壳蛋白基因geneⅢ的去除, 用IPTG诱导其可溶性表达, 对表达产物进行SDS-PAGE, Western-Blot及ELISA鉴定, 并与亲本MAb进行性能对比. 结果表明, 可溶性表达的scFv分子量为27000; scFv与DPPs的交叉反应率比其亲本MAb提高了1.3~3.5倍, 表明其广谱特异性有所提高. 由于scFv与MAb相比具有诸多优点, 因此本研究为有机磷农药多残留检测方法的建立提供了一种更广谱、 更灵敏的新型识别分子.     

酶联免疫吸附分析法检测花生过敏原的研究

本文利用自己研制的花生过敏原免疫新西兰大耳兔,获得效价为200 000的抗花生过敏原特异性抗体,建立了花生过敏原蛋白的间接竞争酶联免疫(ELISA)检测方法.结果表明:花生抗原在0.01～100 ng/mL范围内具有较好的线性关系,其竞争标准曲线为v=-0.1212x+0.9285(r=0.9819),IC50为34....     

超滤法处理改善小鼠单抗的固定化效果

商品化小鼠单抗试剂中普遍添加了高浓度的保护蛋白,如牛血清白蛋白(BSA),这给抗体的固定化带来了严重的干扰。本研究基于超滤技术发展了一种超微量抗体试剂(用量为10μL,约含2μg抗体、100μgBSA)预处理方法,能有效去除商品化抗体试剂中的高浓度BSA,使微珠表面固定化小鼠单抗的数量显著提高,并在蛋白质检测中得到了较好的结果,为缓解抗体产品供应现状对蛋白质芯片研究工作的制约提供了一条简单实用的途径。     

烯效唑酶联免疫吸附分析方法研究

合成了半抗原烯效唑琥珀酸半酯,分别将半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备了免疫抗原和包被抗原,并成功建立了水和土壤中烯效唑残留的酶联免疫吸附分析法。用免疫抗原免疫新西兰大白兔得到多克隆抗体,抗体的效价达到1.02×106。方法的线性范围为0.005～10mg/L,检出限为1.82±0.83μg/L。除烯唑醇有一定的交叉反应外,与大部分三唑类杀菌剂都没有明显的交叉反应。在水和土壤中添加不同浓度的烯效唑,回收率分别在82.40%～105.92%和92.42%～100.08%之间。     

磺胺间甲嘧啶单克隆抗体的制备

研究了磺胺间甲嘧啶单克隆抗体的制备。结果表明,得到三株单抗,其中3F7株抗体效价最高,细胞培养上清为1∶5.2×102,腹水为1∶5.5×105。通过交叉反应试验可知,单抗具有较好的特异性。     

禽流感病毒流式微球量子点探针免疫诊断新方法

采用微波法水相中合成羧基化的绿色量子点,通过羧基与禽流感单克隆抗体氨基的共价结合,制备了检测禽流感病毒的探针,并结合流式微球技术,建立了量子点生物探针流式微球免疫检测禽流感病毒的新方法.以聚苯乙烯微球为蛋白质载体,将多克隆抗体包被到荧光微球上,依次加入待测抗原和量子点生物探针,形成双抗体夹心复合物,用流式细胞仪进行检测.实验结果表明,多抗和单抗的最佳质量浓度分别为92和4 mg/L,检测禽流感病毒比双抗体夹心ELISA灵敏16倍,比FITC标记单抗检测方法灵敏4倍.对阳性尿囊液的检测与ELISA呈现良好的相关性,不与鸡传染性支气管炎病毒、鸡马力克氏病毒、新城疫病毒等发生交叉反应.     

带红系增强子的人βE-珠蛋白基因在转基因小鼠中的表达

本文以我国人中常见的异常血红蛋白E(HbE,β26Glu→Lys,G→A)的β珠蛋白基因为外源基因,用显微注射法制备了人βE-基因的转基因小鼠系。得到的一只整合有16拷贝5′HS2βE重组体的转基因小鼠具有典型的转基因小鼠特征。证实人βE-基因在转基因鼠中的高水平表达需有红系特异性增强子(5′HS2)的存在;说明5′HS2结构对异常珠蛋白基因(βE-)在转基因鼠中的表达也具有明显的增强作用。单一位点整合过多5′HS2βE拷贝平均表达水平(12.1％)明显低于较少拷贝整合的平均表达水平(79.7％),对其发生机制进行了讨论。βE-珠蛋白肽链在转基因鼠中可形成新的血红蛋白四聚体。     

液相色谱法测定抗体与对硫磷、异丙威及其竞争原的吸附常数

为建立一种测定抗体与小分子化合物吸附性能的色谱分析方法,本研究设计合成了5种对硫磷半抗原和2种异丙威半抗原,将半抗原P1和A1与同一载体蛋白偶联制备"多簇"免疫抗原,免疫动物获得相应的多克隆抗体;采用高效液相色谱结合固相吸附的方法,测定了抗体与对硫磷、异丙威及其竞争原的吸附性能,并通过吸附动力学模型拟合抗体与化合物的吸附行为,获得相应的吸附常数。结果表明抗体与小分子化合物的吸附动力学符合Freundilich模型,抗体与不同化合物的吸附常数为:对硫磷>P1>P4>P3>P2>P5,大小顺序与ELISA亲和常数的测定结果相符,与ELISA灵敏度测定结果有很好的相关性。     

MDMV外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

报道了玉米矮花叶病毒(MDMV)全长外壳蛋白cDNA基因的克隆、序列分析和表达产物鉴定的结果。根据其cDNA序列推测的外壳蛋白氨基酸顺序全长共有313个氨基酸,分子量总和为35 400 D,与聚丙烯酰胺凝胶电泳估算的值36 000 D相近,克隆的病毒外壳蛋白基因cDNA 3′-末端非编码区含有256个碱基。将此外壳蛋白的基因插入pUC19的1acZ基因中,转入E.coli后诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈现一特异性的蛋白带,经Western吸印与抗MDMV的兔血清呈阳性反应,证实所克隆的cDNA基因为MDMV外壳蛋白基因,并且能够正确表达。