13C辅助的超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用方法精确分析毕赤酵母胞内代谢物浓度

毕赤酵母作为一种高效的外源蛋白表达平台,其蛋白表达水平与胞内代谢物浓度紧密相关.但胞内代谢物种类多、物化性质差异大、浓度低、周转快,对其绝对浓度的精确检测一直难于实现.本研究将超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用分析方法与13C同位素标记技术相结合,探索解决该难题的方法.首先,优化了超高效液相色谱的操作条件,利用3种色谱柱实现了64种常见中间代谢物的分离;对三重四极杆质谱仪的检测离子对和碰撞电压等操作条件进行优化,找到了对各种物质具有专一性的检测离子对.然后,利用全标记13C标记底物培养细胞,收集胞内的全标记代谢物用作定量内标物,建立了53种中间代谢物的标准曲线.实验结果表明,本方法不但精确性高,标准曲线相关系数达到0.99以上,而且重现性好,受实验条件和仪器操作条件的影响很小.将本方法应用于毕赤酵母胞内代谢物浓度的绝对定量分析,成功获得了胞内各种代谢物的浓度水平,为后续深入研究毕赤酵母代谢调控机理,实现外源蛋白的高效生产奠定了基础.     

一种含光亲和标记异戊烯侧链探针的合成与初步表征

经5步反应、以9%的总收率合成了一种含生物素修饰和光亲和标记的异戊烯侧链功能探针分子, 初步考察了反应条件下该探针分子与Saccharomyces cerevisiae AS 2.399粗蛋白的相互作用; 生物素印迹分析结果表明, 酵母中多种蛋白被探针分子修饰, 为进一步开展化学蛋白组学研究奠定了基础.     

基于3种非天然糖代谢标记的分泌蛋白质组分析性能对比

分泌蛋白质是调控细胞间信号转导的重要生物大分子。由于分泌蛋白的丰度相比于胞内蛋白以及培养基添加剂更低,因此分泌蛋白的高通量鉴定是目前蛋白质组学界研究的热点和难点。目前,基于生物质谱的分泌蛋白质组学分析一般均需要从无血清的条件培养基中获得分泌蛋白质,再对其进行富集和分析。该流程操作步骤繁琐,易造成分泌蛋白质的损失和降解。本工作采用基于生物正交化学生物学技术实现对分泌蛋白质的高选择性标记和高效富集。通过结合点击化学技术,综合评估了分泌蛋白质分析中用于代谢标记的不同糖类似物。采用3种最常用的商品化糖类似物,N-叠氮乙酰甘露糖胺(ManNAz)、N-叠氮乙酰半乳糖胺(GalNAz)和N-叠氮乙酰葡萄糖胺(GlcNAz)分别对HeLa细胞进行代谢标记,之后通过炔基生物素探针对条件培养基中的分泌蛋白进行富集,结合质谱分析来对比3种糖类似物对分泌蛋白的标记效率。最后通过无标定量蛋白质组学分析,系统评估了3种糖类似物用于分泌蛋白质组分析的性能。结果表明,基于ManNAz的分泌蛋白标记方法鉴定到了282个分泌蛋白、224个细胞质膜蛋白以及846个N-糖基化位点;对分泌蛋白的富集效率分别较GalNAz和GlcNAz提高了130%和67.2%;对细胞质膜蛋白的富集效率较GalNAz和GlcNAz分别提高了273.3%和148.7%,体现出了明显的优势。本研究的实验结果为分泌蛋白高选择性富集和系统分析提供了有益的对比分析和新技术策略。     

非标记液相色谱-质谱联用蛋白组学并行分析策略研究

在双酶双碎裂条件下,建立了针对非标记液相色谱-质谱联用蛋白质组学的并行分析策略.应用拥有碰撞诱导解离(CID)和电子转移解离(ETD)两种碎裂方式的液相色谱-质谱联用对经胰蛋白酶和V8酶分别酶解的牛血清白蛋白(BSA)、大肠杆菌及复杂血清样品进行检测.与单酶酶解比较,双酶酶解的蛋白总发现率增加了11%,蛋白总覆盖率可增...     

荧光标记寡核苷酸的反相离子对色谱分析

建立荧光标记寡核苷酸反相离子对色谱分析方法,优化了流动相醋酸三乙胺浓度(0～0.15 mol/L), pH 4.5～7.0和洗脱强度等色谱条件.对5-mer, 10-mer和15-mer非标记和5'-羧基荧光素(5'FAM)标记寡核苷酸的保留进行比较分析,研究荧光标记寡核苷酸的保留机理,并分离TaqMan~(TM)探针等多种常用荧光标记寡核苷酸.结果显示,不同长度荧光标记寡核苷酸在0.01 mol/L醋酸三乙胺,pH 7.0的条件下获得最大分离.荧光标记寡核苷酸的保留与非标记寡核苷酸有明显差异,两者可完全分离.在一定长度范围内非标记寡核苷酸随长度的增加,保留时间增长;相反,荧光标记寡核苷酸的长度增加,保留时间减短.荧光染料疏水性对其标记的寡核苷酸在反相柱中的保留有较大影响,荧光染料疏水性越强,其标记寡核苷酸保留时间越长.但疏水性的影响程度随标记寡核苷酸长度增加而逐渐变小.     

螯合稀土金属标记蛋白质技术的建立与优化

建立了一种基于螯合稀土金属标记蛋白质的技术,优化了影响标记效率的各种条件.在50 mmol/L TEAB缓冲体系(pH 7.5),DTPA与肽段摩尔比为100: 1,常温反应30 min的条件下,DTPA标记完全;在100 mmol/L乙酸铵缓冲液(pH 6.0),稀土金属与DTPA摩尔比为4: 1,37 ℃反应1 h的条件下,稀土金属螯合反应完全.考察了不同稀土金属的螯合效率,发现离子半径最小的Lu螯合效率最高.本方法被成功应用于肽混合物标记.     

痕量铜蓝蛋白的免疫纳米金催化-氧化亚铜微粒共振散射光谱分析

用15 nm的纳米金标记羊抗人铜蓝蛋白抗体(GCP)可获得铜蓝蛋白(CP)纳米金探针(AuGCP). 在pH 7.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中, CP与AuGCP发生特异性结合生成胶体金免疫复合物. 离心分离后, 离心液中的AuGCP可作为酒石酸铜(C4H4O6Cu)-葡萄糖反应体系的催化剂, 生成的Cu2O微粒在620 nm处有一共振散射峰. 在选定条件下, 620 nm处共振散射信号降低值△I620 nm与铜蓝蛋白浓度cCP在0.18～45 ng/mL范围内存在良好线性关系, 回归方程为 ΔI620 nm＝2.27cCP＋5.05, 相关系数为0.9940, 检出限为0.14 ng/mL. 该法用于人血清中铜蓝蛋白的检测, 结果满意.     

基于AuNPs/PDDA-GO纳米复合物的电化学免疫传感器的构建及对SirT1蛋白的检测

基于AuNPs/PDDA-GO纳米复合物制备了一种新型电化学免疫传感器, 并将其用于SirT1的检测. 首先, 在电极表面修饰复合材料AuNPs/PDDA-GO, 然后将目标蛋白SirT1固定到修饰了AuNPs/PDDA-GO的电极表面, 再通过特异性免疫反应结合一抗(Ab₁)和辣根过氧化酶标记的二抗分子(HRP-Ab₂), 最后用示差脉冲伏安法检测电流信号, 实现了对SirT1蛋白水平的测定. 在优化的实验条件下, SirT1蛋白的浓度在0.1~100 ng/mL范围内与响应电流呈良好线性关系, 检出限为0.029 ng/mL.     

牛血清蛋白质三维有序大孔材料

用胶体晶体为模板制备了牛血清白蛋白和异硫氰基荧光素标记的牛血清白蛋白的三维有序大孔材料. 表征了孔材料的结构和荧光发射光谱. 表明所制备的孔材料具有规整的三维有序孔结构, 荧光素标记的牛血清白蛋白三维有序大孔材料具有良好的荧光发射性质.     

利用互补核酸杂交富集金胶实现信号扩增的电化学凝血酶蛋白生物传感器研究

介绍了一种利用互补核酸杂交富集金胶实现信号扩增的蛋白质生物传感器. 以凝血酶蛋白为研究对象, 利用凝血酶蛋白相对应的两段核酸适配体, 将适配体Ⅰ固定在磁性颗粒上, 用于特异性地捕获蛋白, 将适配体Ⅱ标记金胶作为检测信标. 由凝血酶蛋白和相对应的两段核酸适配体构建三明治结构的凝血酶蛋白生物传感器. 另外, 再通过信标金胶上过剩的核酸适配体链与另一段标记有金胶的互补核酸进一步杂交, 获得金胶的选择性聚集, 实现了信号扩增. 通过信号扩增, 使此传感器的灵敏度大大提高, 对凝血酶蛋白的检测下限可达到4.52×10-15 mol/L. 平行测定浓度为7.47×10-14 mol/L的凝血酶8次, 其RSD为3.0%. 该生物传感器对凝血酶蛋白有很好的特异性, 其它蛋白如溶菌酶和牛血清白蛋白的存在对于检测没有影响.