hG-CSF cDNA 5′端序列修饰对其在原核细胞中表达的影响

本文设计并构建了人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)三种cDNA突变体表达质粒,对影响hG-CSF cDNA在大肠杆菌中表达效率的因素进行了探讨。指出cDNA 5′端起始密码子ATG的上、下游序列对其表达有显著影响。不同因素影响hG-CSF cDNA在大肠杆菌中表达效率的主要调控环节在转录水平;翻译水平的差别亦可能与其表达效率的不同有一定关系。     

人类端粒DNA的分子识别及其作用机制探讨

核酸中富含短的G-碱基重复的序列可以形成一种复杂的高级结构,称为G-四链体（G-quadruplex）.在基因组中,借助生物信息学发现这类富G序列广泛分布在基因的启动子区,特别是那些参与到复制中去的基因,例如癌基因.同时发现这类序列在mRNA的5′非翻译区（5′UTR）也广泛存在.这类序列在染色体末段端粒部位的存在及功能已得到充分阐明.已知端粒富含G-碱基序列,其3′末端以单链状态存在,这使得在一些小分子的选择性作用下端粒序列很容易形成G-四链体结构,进而破坏端粒结构,影响端粒酶活性.已知端粒酶在超过85%的肿瘤中过量表达,因此,端粒酶已经成为抗癌药物设计的特殊靶点,是目前本领域的研究热点之一.已发现系列配体通过有效抑制端粒酶而表现高的抗肿瘤活性.本文主要综述了近年来端粒G-四链体分子识别及其药物靶向的最新进展,并对其作用机理做了进一步的分析和探讨.     

乙型肝炎病毒核心抗原基因结构对其在大肠杆菌中表达的影响

本文将含乙型肝炎(以下简称乙肝)病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)基因的1kbHhaI酶切HBV·DNA片段用BAL-31外切酶切除两端非编码区,连接EcoRI合成接头后插入到载体pUR222的EcoRI位点,转化受体菌后筛到一系列不同HBcAg表达水平的重组体。分析高表达和低表达重组体工作中,发现在同一乳糖启动子、核糖体结合部位(SD序列)和Lac Z基因N端第5氨基酸后连接的HBcAg基因,由于在ATG5′端上游—7至—35核苷酸区有一呈部分迥文的序列,当转录成mRNA时可形成一环茎二级结构,是否用BAL—31酶切除此结构对表达水平影响极大。高表达重组体HBcAg产量可占菌体总蛋白9％,低表达的只为其千分之一。本文并对此现象在原核细胞中表达真核基因的意义进行了讨论。     

hKv4.3基因5′非翻译区序列S160功能分析

hKv4.3基因是形成瞬时外向钾电流Ito的主要分子基础,它在心脏和神经细胞中大量表达,但在其它组织中则未见大量表达.为了研究hKv4.3表达在基因水平的调节,将hKv4.3基因的5′非翻译区的一段序列( 2~ 160,称之为S160)克隆到报告质粒中,进行瞬时表达.发现S160对hKv4.3基因的启动子和SV40的启动子都有强烈的抑制作用,没有方向特异性,但却有位置特异性.经删除突变分析,在S160片段中发现了一个抑制元件S(GAGGGGTTAA),它位于hKv4.3基因中转录起始位点下游20~30bp处.在此基础上,用RT-PCR方法对mRNA进行定量分析,初步确认这个抑制元件对蛋白表达的抑制过程是在翻译水平上.     

水稻种子贮存蛋白Prolamin 4a基因的组织特异性表达调控

本文分离了水稻中花8号种子贮存蛋白Prolamin基因的5′端调控区域,对其DNA的全序列结构作了分析,表现启动子DNA的典型序列结构。构建了GUS融合基因,利用农杆菌LBA4404双元载体系统转化烟草,分子杂交获得转基因烟草植株,在转基因烟草开花20天时,对烟草种子作GUS基因表达的组织化学分析。实验结果表明Prolamin基因的启动子在种子的胚乳中激活下游GUS基因的表达,这是水稻Prolamin基因5′端调控序列功能的首次报道。     

大鼠颗粒细胞tPA和PAI-1表达的激素调控

本文研究了促性腺激素(FSH和LH)和促性腺激素释放激素(GnRH)类似物(GnRHa)对大鼠颗粒细胞(GC)tPA和PAI-1表达的调节。(1)FSH和LH及GnRHa或大蓟二萜醇-12-14烷基-13乙酸盐(PMA)可单独刺激GC分泌tPA;FSH(或LH)与GnRHa(或PMA)共同作用于GC时所增加的tPA活性比两者单独作用之和要高;(2)FSH和LH降低GC的PAI-1活性,而GnRHa和PMA则明显刺激GC的PAI-1活性和PAI-1 mRNA水平;(3)GnRHa和PMA刺激GC的PAI-1活性和PAI-1的mRNA水平;但在FSH或LH存在的情况下这种刺激受到完全抑制。因此促性腺激素和GnRHa对GC tPA和PAI-1表达的调控机制可能是不同的。     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及其植物表达载体的构建

从感病的萝卜叶片中得到芜菁花叶病毒(TuMV)的分离物,以oligo(dT)为引物,合成了其基因组RNA的互补DNA,并克隆到载体λ-ZAPⅡ中。通过单链cDNA探针杂交和DNA末端序列分析找出含有poly-A尾巴的阳性克隆。我们对一个含有1429个碱基插入片断的克隆进行了序列分析,根据芜菁花叶病毒外壳蛋白分子量的大小和马铃薯Y病毒组蛋白质加工位点氨基酸序列的保守性,确定了外壳蛋白基因的5′末端。利用PCR方法对其5′末端进行改造,加进起始密码ATG和两个限制性内切酶位点。通过基因重组操作,将该基因插入到双元载体pBI121的衍生物pBIN437中,得到芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体。     

反义c-Ha-ras寡聚核苷酸对转化细胞的生长抑制及其p21蛋白合成的抑制

本文合成了两个15聚核苷酸AS-1和AS-2,前者与c-Ha-ras mRNA的前三个密码子及其上游的核蛋白体结合点附近的单链区互补,后者与细胞核内未成熟c-Ha-rag RNA第一内含子3′端及第二外显子5′端区域互补,它们可分别阻断c-Ha-ras mRNA的翻译和拼接过程,从而降低c-Ha-ras癌基因的表达水平,抑制了转化细胞的增殖。这种抑制作用随浓度的增加(从4μmol/L至10μmol/L)而增加,加入AS-1或AS-2 12h后抑制作用达到高峰,以后逐渐下降。用ELISA方法测定转化细胞中c-Ha-ras产物p21蛋白水平,结果显示增殖受抑制细胞p21水平较对照细胞降低30％左右。     

双金属协同调控G-三链体/血红素比色传感探针的构筑及应用

该文首次将一条富含G碱基的DNA序列(5’-CTGGGAGGGAGGGA-3’)与血红素结合,形成的G-三链体/血红素复合物具有类过氧化氢酶活性,能够催化H₂O₂的氧化反应,使反应底物2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)由无色变为绿色。通过对金属离子的筛选,发现K⁺和Sr²⁺同时存在能稳定G-三链体结构,基于此构筑了双金属协同调控的G-三链体/血红素比色传感探针,并将其用于H₂O₂的定量分析。在最佳实验条件下,溶液的吸光度与H₂O₂浓度在0.5～4.5 mmol/L范围内呈现良好的线性关系,检出限为0.07 mmol/L。将该方法用于牛奶中H₂O₂的检测,加标回收率为92.5%～103%,相对标准偏差为1.2%～5.4%。该探针具有碱基序列短、成本低廉、适用性强等诸多优势,为G-三链体功能化核酸探针的研究提供了新的思路。     

人表皮生长因子受体cDNA在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达

人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor,简称hEGFR)是一个170kD的穿膜糖蛋白。利用酵母诱导型Gall启动子,hEGFR cDNA被成功地在酵母细胞中表达,其转录产物(mRNA)大小约为3.5kb。免疫荧光显微实验显示该mRNA的翻译产物(hEGFRy)是位于酵母细胞质膜上,并且hEGFRy具有与EGF结合的功能。本文还进一步证明了酵母2μm质粒的2kb的片段的确具有转录终止的功能。     

分子信标用于p53 mRNA的体外定量检测

根据p53基因的序列设计并合成了能特异性检测p53 mRNA的分子信标(MB), 发展了一种快速定量测定细胞内总RNA提取物中p53 mRNA的方法. 采用鼻咽癌(CNE2)细胞系和经RNA干扰技术降低p53基因表达的CNE2-p53RNAi细胞系, 抽提总RNA并用MB检测, 验证了MB的检测对象是p53 mRNA. 将该方法应用于多种肿瘤细胞内p53基因表达水平的分析, 表达变化趋势与经典的mRNA分析方法RT-PCR检测结果相符. 在此基础上, 用MB对5-氟尿嘧啶(5-Fu)处理的肺腺癌细胞(A549)进行了p53 mRNA的体外定量检测, 结果表明采用MB能够快速地获知该药物对细胞内p53 mRNA表达影响的信息.     

带红系增强子的人βE-珠蛋白基因在转基因小鼠中的表达

本文以我国人中常见的异常血红蛋白E(HbE,β26Glu→Lys,G→A)的β珠蛋白基因为外源基因,用显微注射法制备了人βE-基因的转基因小鼠系。得到的一只整合有16拷贝5′HS2βE重组体的转基因小鼠具有典型的转基因小鼠特征。证实人βE-基因在转基因鼠中的高水平表达需有红系特异性增强子(5′HS2)的存在;说明5′HS2结构对异常珠蛋白基因(βE-)在转基因鼠中的表达也具有明显的增强作用。单一位点整合过多5′HS2βE拷贝平均表达水平(12.1％)明显低于较少拷贝整合的平均表达水平(79.7％),对其发生机制进行了讨论。βE-珠蛋白肽链在转基因鼠中可形成新的血红蛋白四聚体。     

人凝血Ⅸ因子cDNA在转基因小鼠内的表达调控

为了研究人凝血IX因子cDNA在转基因小鼠内的表达,特别是顺式调节顺序的存在位置,本文将3种具有不同结构的人凝血IX因子cDNA的重组基因导入离体培养细胞,发现外源的人IX因子cDNA都能表达人IX因子蛋白,进而将它们分别作成转基因小鼠,结果发现在转基因小鼠内都失去了表达特性。这些结果证实了在人凝血IX因子cDNA中存在着决定其在转基因小鼠内表达的顺式调节顺序,同时也排除了这种顺式调节顺序存在于3′端非编码顺序中的可能性。作者再结合一些相关研究的结果,认为其顺式调节顺序可能存在于5′端的非编码顺序中。     

含双dppz配体的钌(Ⅱ)配合物与G-四联体的相互作用研究

应用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、热变性、圆二色谱等方法在K+溶液中研究了富含鸟嘌呤的G-四联体(AG3(T2AG3)3)与钌髤配合物[Ru(L)(dppz)2](PF6)4(L=5,5′-二(三正丁胺基甲基)-2,2′-联吡啶离子,dppz=二吡啶并[3,2-a∶2′,3′-c]吩嗪)的相互作用。紫外和荧光滴定实验表明,配合物与G-四联体之间存在较强的亲和力,拟合得到的结合常数可达107;从热变性实验可以看出,该配合物能够有效地稳定DNA的四螺旋结构。     

马铃薯Y病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析

以马铃薯Y病毒(PVY,中国分离株)基因组RNA的cDNA为模板,我们用聚合酶连锁反应(PCR)合成了完整的外壳蛋白(CP)基因及部分3′末端非编码区序列。在5′-引物Y5中引入了限制性酶NcoI位点及起始密码AUG,3′-引物Y3中引入了Sall位点。PCR产物经NcoI及Sall双酶切后克隆入pGEM衍生质粒,并测定了其中一个克隆pPCY6的CP基因的序列,以此克隆的CP基因片段作探针,从cDNA库中钓出相关的几个克隆,并测定了序列,由此我们获得了包含部分NIb基因,全部的CP基因及3′-非编码区共1317个碱基。序列分析表明,该株系CP基因核苷酸序列与0株系同源性(94.2％)较与N株系(89.6％)同源性稍高,但氨基酸序列的同源性差别不大(分别为93.3％及91.8％)。目前我们已将该基因克隆入双元载体pBI121.1,并通过脓杆菌转化马铃薯,以期得到抗PVY的马铃薯工程株。     

MDMV外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

报道了玉米矮花叶病毒(MDMV)全长外壳蛋白cDNA基因的克隆、序列分析和表达产物鉴定的结果。根据其cDNA序列推测的外壳蛋白氨基酸顺序全长共有313个氨基酸,分子量总和为35 400 D,与聚丙烯酰胺凝胶电泳估算的值36 000 D相近,克隆的病毒外壳蛋白基因cDNA 3′-末端非编码区含有256个碱基。将此外壳蛋白的基因插入pUC19的1acZ基因中,转入E.coli后诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析呈现一特异性的蛋白带,经Western吸印与抗MDMV的兔血清呈阳性反应,证实所克隆的cDNA基因为MDMV外壳蛋白基因,并且能够正确表达。     

基于分子信标定量检测肿瘤细胞p21 mRNA表达变化

根据p21基因序列设计合成特异性检测p21 mRNA的分子信标, 发展了一种体外快速、定量检测p21 mRNA的新方法, 将其用于肿瘤细胞p21 mRNA表达水平的检测. 结果发现: 抑制p53表达引起CNE2细胞中p21 mRNA表达水平降低, 转染ING1诱导MCF-7细胞中p21 mRNA表达上调, 5-氟尿嘧啶处理MCF-7细胞后p21 mRNA表达水平呈浓度和时间相关性变化. 这种特异性强、操作快速、简便的新方法有望广泛用于各类样品中p21 mRNA表达水平检测.     

Janus纳米金稳定的Pickering乳液界面催化氧化性能

Janus纳米粒子的结构设计和简易合成是Pickering乳液界面催化的关键. 本文通过在Pickering乳液保护法中操纵共轭亚油酸的自组装、 自交联性和弱还原性, 合成了Janus型自交联吸附胶束修饰的纳米Fe₃O₄ (SCA-Fe₃O₄), 并在其表面原位还原金后, 合成了Janus型催化剂Au-SCA-Fe₃O₄, 考察其同时作为乳化剂和催化剂在乳液界面催化苯甲醇氧化生成苯甲醛的性能. 结果表明, 该Janus纳米粒子的金修饰量(质量分数)仅为0.66%, 兼具乳化性、 催化性和磁响应性. Au-SCA-Fe₃O₄可制备外观稳定(100 μm)和热稳定(90 ℃)的苯甲醇/水型Pickering乳液, 可显著提高互不相溶反应物与催化剂间的接触面积, 使其催化活性达到均匀纳米催化剂的2倍和非乳液催化时的3倍, 其在界面的不可转动性使苯甲醛的选择性高于99.9%, 避免了苯甲醛被过度氧化成苯甲酸.     

胞质因子对人早幼粒白血病细胞恶性表型和基因表达的调控作用

本文利用胞质杂交的细胞工程手段,研究人早幼粒白血病细胞突变株在添加小鼠网织红细胞胞质后的细胞恶性表型表达状态。实验结果表明,HGPRT~-人早幼粒白血病细胞突交株(HL-60-AR)与小鼠网织红细胞融合所形成的胞质杂交细胞,其恶性程度较亲本瘤细胞显著降低,它们在体外软琼脂培养基上不能形成集落,在裸鼠体内丧失致瘤能力,同时细胞增殖率降低,细胞分裂指数下降,DNA合成速率减慢。利用c-myc癌基因探针的分子杂交技术,未检测到胞质杂交细胞存在相当于c-myc基因特异的同源序列mRNA,提示杂交细胞癌基因表达严重受抑。对杂交细胞珠蛋白在翻译和转录水平上的表达分别进行探测,结果一致显示胞质杂交细胞中人珠蛋白基因受到激活。上述结果提示,小鼠网织红细胞中存在能调控人肿瘤细胞恶性表型和基因表达状态的胞质因子。     

tPA Kringle-2结构域基因的合成及其在大肠杆菌中表达

本文用固相磷酸三酯法合成了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)174-262片段(Kringle-2结构域)对应的DNA序列。利用PIN Ⅲ OmpA2表达质粒的信号序列和Plpp-lac启动子在大肠杆菌中表达了tPA Kringle-2。约2/3的表达产物分泌在大肠杆菌的周间质中。经硫酸铵盐析,Lysine-Sepharose亲和层析和FPLC-MONOQ离子交换层析等3步纯化后其氨基酸组成和tPA 174-262片段的组成一致。放射结合分析证明重组表达的tPA Kringle-2具有纤维蛋白结合活性。