全二维液相色谱(NPLC×RPLC)接口及其应用

用内径为0.53 mm的填充毛细管正相液相色谱为第一维, 用4.6 mm(i.d.)×50 mm RP-18e整体柱反相色谱为第二维, 建立了定量环-阀切换接口的全二维液相色谱系统(NPLC×RPLC). 第一维色谱分离洗脱出的组分交替存储在十通阀上的两个定量环中, 同时定量环中前一个组分被转移到第二维进行反相分离. 因为第一维的流动相流量仅是第二维的1/500, 自然解决了流动相兼容问题. 采用芳香族化合物的混合物和中药丹参正己烷提取液对该全二维液相系统的分离能力进行了评价.     

真空溶剂蒸发全二维液相色谱接口及其应用

以正相色谱(NPLC)为第一维,反相色谱(RPLC)为第二维,建立了真空溶剂蒸发接口的全二维液相色谱系统(VEI-C2DLC)。样品首先在第一维(CN色谱柱)进行正相分离,第一维洗脱产物被交替存储到十通阀上的两个定量环中,与此同时对切割到定量环内的第一维组分进行在线真空蒸发,被分析样品组分保留在定量环内壁内,而溶剂被蒸发除去。十通阀切换后保留在该定量环内的样品组分被洗脱到第二维进行反相分离,如此反复循环使第一维组分完全转移到第二维。采用标准样品和天然植物蛇床子提取液对该全二维液相系统进行了评价。     

高温正相色谱/反相色谱(HTNPLC/RPLC)二维联用系统的构建与应用

为解决含水正相色谱与反相色谱联用过程中的谱带展宽问题,以高温正相色谱(HTNPLC)为第一维,室温反相色谱(RPLC)为第二维,分别建立了切割模式的二维液相色谱(HTNPLC-μRPLC)和全二维液相色谱(HTNPLC×RPLC)系统.样品首先在第一维(CN色谱柱)进行正相分离,第一维洗脱产物选择性地或者交替存储在十通阀上的定量环中,然后切换十通阀将定量环内存储的样品组分转移到第二维(C18色谱柱)进行反相分离.该系统降低了第一维切割组分在第二维柱头的扩散,提高了分离度以及分离效率.采用多环芳烃混合物和天然植物甘草提取液对该二维液相色谱系统进行了评价.     

高分辨采样二维液相色谱法同时测定金银花中绿原酸和木犀草苷含量

采用高分辨采样二维液相色谱法（HiRes 2D-LC）对金银花中绿原酸和木犀草苷进行准确定量分析。第一维液相色谱采用C18色谱柱，以乙腈和0.4%（v/v）磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；第二维液相色谱采用SB-Phenyl色谱柱，以乙腈和0.5%（v/v）乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱；二维接口采用五位十通阀，并配置2个多中心切割阀，对绿原酸组分和木犀草苷组分进行多次连续切割。实验结果表明，二维液相色谱分析提高了绿原酸和木犀草苷色谱峰的确认能力，可揭示一维液相色谱分析中共洗脱或隐藏峰的信息；高分辨采样模式实现了一维目标组分的片段式整峰切割，提高了二维液相色谱分析的准确定量能力；通过线性关系、基质加标回收和重复性等考察结果，表明高分辨采样二维液相色谱具有优异的定量准确性和重复性，为中药等复杂基质组分样品的分离和准确定量提供了新方法。     

正相模式/反相模式的二维液相色谱系统的构建与应用

以4.6mm×50 mm i. d.的Hypersil SiO2正相色谱柱为第一维,4.6mm×250 mm i. d.的Kromasil C18反相色谱柱为第二维,通过升高第二维色谱温度的方法增加两维流动相间互溶性的方法构建了定量环-阀切换接口的二维液相色谱系统(NPLC×RPLC)。根据有机溶剂的特征,在第一维正相色谱流动相中加入二氧六环;第二维反相色谱流动相中加入异丙醇,在改善流动相兼容性的同时,有效调整分离选择性。采用此系统对正天丸样品进行分离分析,达到1120的峰容量。     

离线全二维逆流色谱-液相色谱分离莪术油成分

中药挥发油成分复杂,一维色谱分离由于有限的峰容量难以完全分离中药挥发油成分,全二维气相色谱为分离挥发油成分提供了有力的方法,然而气相色谱一般无法用于天然活性成分的筛选。为建立挥发油成分全二维色谱分析新方法,研究建立以液相色谱为基础的全二维色谱分离分析方法。本文主要研究全二维逆流色谱-液相色谱分离莪术油成分的方法,并探讨两种色谱技术之间的正交性,为活性成分筛选提供新的技术支持。通过优化离线全二维逆流色谱-液相色谱分离方法,对全二维色谱峰容量、正交性和空间覆盖率进行度量。优化液相色谱分析条件并筛选逆流色谱分离两相溶剂体系,通过比色法筛选了逆流色谱两相溶剂体系并采用下相为流动相进行梯度洗脱。在290～375 min采用推挤洗脱,莪术油在第一维逆流色谱分离中达到了良好的分离。第二维反相高效液相色谱的流动相组成为乙腈(A)和水(B)。梯度洗脱程序为0～10 min, 50%A～65%A; 10～14 min, 65%A; 14～21 min, 65%A～85%A; 21～25 min, 85%A～95%A; 25～30 min, 95%A～55%A; 30～40 min, 55%A。在上述条件下...     

全二维液相色谱的初步构建及其在山羊血清分离中的应用

以GFC/RP模式构建全二维液相色谱系统,第一维凝胶过滤色谱柱使用ShodexProteinKW 802. 5(300mm×8mmi.d. ),以0. 2mol/LNaH2PO4 (pH7. 0)的流动相在0. 15mL/min的流速下等度洗脱,第二维反相色谱柱使用HypersilBDSC18 (35mm×4. 6mmi.d. ),在3mL/min的流速下梯度洗脱。采用平行柱交替分析的形式作切换接口, 2. 5min切换一次,两个反相柱交替富集、分析第一维洗脱产物。以5个标准蛋白混合物的分离评价该系统,在单独一维模式中不能分离的样品在全二维液相色谱中得到了较好的分离,二维系统的总峰容量为225。与一维色谱相比,系统的总峰容量、分辨率得到较大提高。并用于山羊血清的纯化分析,对一维分离中的重合谱峰进行验证,对制备纯化有一定的实际意义。     

高温二维液相色谱系统的构建及其评价

在二维液相色谱中, 第二维的分离速度是制约其发展的重要因素. 升高色谱柱温度可以有效降低流动相粘度, 加快溶质在两相间的传质速率, 有效加快分析速度. 以离子交换色谱法(WAX)为第一维分离模式和反相色谱法(RP)为第二维分离模式, 十通阀和两个捕集柱为接口, 通过将第二维色谱柱温度升高到80 ℃和提高流量到3 mL/min, 构建了高温WAX/RP二维液相色谱系统. 以4种标准蛋白的酶解物为样品评价系统的分离性能, 第一维共有33个馏分被捕集并导入到第二维分析, 高温二维液相色谱系统识别出187个色谱峰.     

色谱最新研究亮点

1 多维分离技术新进展 一维色谱是目前最常用的分离分析方法,然而对于复杂体系如蛋白质组,采用一维分离模式其分离度远远不能满足要求.Giddings理论告诉我们:对于分离机理相互正交的二维分离系统(如色谱),峰的容量应该为两个色谱柱峰容量的乘积.因此,多维分离系统是解决复杂分离体系的一个最佳选择.在多维色谱中二维气相色谱发展较快,目前全二维气相色谱仪业已商品化,其峰的容量达到104以上.而二维液相色谱,尤其是正相/反相二维液相色谱技术发展较为缓慢,其主要的技术瓶颈在于第一维色谱(正相)分离后的流动相严重干扰第二维色谱(反相)的分离.     

六昧地黄丸组分的二维液相色谱分离

以1个常规六通阀直接连接两支常规尺寸的色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.),构建简单的SCX/RP在线二维液相色谱系统,对中成药六味地黄丸组分进行了优化分离.样品经过第一维阳离子交换色谱(Hypersil SCX),洗脱产物分离后通过六通阀直接富集到反相分析柱(C18)顶端,被转移到第二维色谱柱上继续进行分离.经过11步不连续的线性梯度洗脱,二维分离系统出峰数量达到550多个,峰容量达到2266.构建的二维液相色谱系统结构简单,与一维色谱相比,具有分辨率高、峰容量大的特点.     

二维液相色谱接口的改进及其在蛋白质组学研究中的应用

随着蛋白质组学、本草物质组学等组学概念的提出,所需分析的样品的成分越来越复杂,因此具有强大分离能力的多维液相色谱技术受到人们越来越多的关注。二维液相色谱中第二维的分离性能和速度是整个分离系统性能的关键。基于捕集柱模式,我们采用经特殊设计的流路系统,使得双捕集柱型接口具有预分离的功能。样品从第一维流出以后被富集在捕集柱1的柱头,经过脱盐后,正冲捕集柱,捕集柱1与第二维色谱柱联用对富集的样品进行分离,增加了第二维分离效率。当捕集柱上的样品全部被洗脱到第二维色谱柱上时,捕集柱2已经完成对第一维洗脱液中样品的捕集和脱盐,此时将阀进行切换,捕集柱2与第二维色谱柱直接相连进行洗脱。循环切换捕集柱1和捕集柱2,维持较高的阀切换频率,实现了第二维色谱柱的连续洗脱。因此保证了第二维分离具有较快速度,同时具有较高的分离效率。使用35 mm长捕集柱和十通阀为接口,以弱阴离子交换(WAX)色谱为第一维分离模式,以反相(RP)色谱为第二维分离模式,构建了WAX-RP二维液相色谱系统(2D-LC system)。以小鼠血清为样品对系统进行了初步评价。色谱流出曲线出现了明显的界面现象,这是由于捕集柱流动相中含有的较多盐分流出时的背景吸收造成的。同时,由于界面两侧的流动相黏度不同产生了黏性指进(VF)现象。当第二维色谱柱长度为50 mm时,理论上可将第二维分离效能提高70%。该接口可以应用于多种二维液相色谱模式,适用于蛋白质组学和本草物质组学研究中对于复杂样品的分离分析。     

六味地黄丸组分的二维液相色谱分离

以1个常规六通阀直接连接两支常规尺寸的色谱柱(250 mm×4.6 mm i.d.),构建简单的SCX/RP在线二维液相色谱系统,对中成药六味地黄丸组分进行了优化分离。样品经过第一维阳离子交换色谱(Hypersil SCX),洗脱产物分离后通过六通阀直接富集到反相分析柱(C18)顶端,被转移到第二维色谱柱上继续进行分离。经过11步不连续的线性梯度洗脱,二维分离系统出峰数量达到550多个,峰容量达到2266。构建的二维液相色谱系统结构简单,与一维色谱相比,具有分辨率高、峰容量大的特点。     

NEWS

高效液相色谱的应用范围十分广泛,约有80％的有机物均可使用高效液相色谱进行分析。近年来其发展颇为迅猛,功能不断完善。2006年获得匹兹堡金奖产品的赛默飞UltiMate 3000 DGLC双三元液相色谱,便是杰出的代表。其采用独特的双泵设计,每个泵作为一个单独的体系,有各自独立的比例阀和流动相体系,同时单独控制三种不同的流动相,在Chromeleon变色龙软件的支持下,结合独特的阀切换技术,通过灵活的流路连接设计,一套系统即可以轻松实现在线固相萃取、中心切割及全二维液相色谱分离、流动相在线除盐、柱后衍生和反梯度补偿、并联/串联色谱等高级应用。本刊中有多篇文章利用UltiMate 3000 DGLC双三元液相色谱的在线固相萃取( online SPE)技术和二维及全二维液相色谱分离技术,解决了他们遇到的复杂难题。     

二维反相液相色谱制备五味子中的木脂素

应用自主研发的具有分离-富集模式的制备色谱工厂,建立了分离制备五味子木脂素有效部位及其单体化合物的方法。该方法首先以C₁₈（250 mm×4.6 mm,5 μm）为色谱柱,水和甲醇为流动相,分离度和保留时间为考察指标,采集4个不同梯度的色谱信息,通过XTool色谱专家系统软件模拟,确定五味子木脂素第一、二维色谱条件;然后采用线性放大的方法,以C₁₈（250 mm×30 mm,10 μm）为第一、二维分离柱,C₁₈（80 mm×30 mm,10 μm）为富集柱,水为富集稀释液,对五味子木脂素进行二维色谱分离纯化;最后第一维分离得到9个可重复组分,第二维分离得到20个高纯度化合物,其中有6个单体化合物。结果表明该法重现性良好,可以实现五味子木脂素的系统性分离,对五味子化学成分的研究具有重要意义。     

二维液相色谱(SCX/RP)系统的构建及对珠蛋白水解产物的研究

以十通阀为切换接口, 构建了SCX/RP常规柱二维液相色谱系统, 并以珠蛋白水解产物的分析对其加以评价. 样品首先由第一维阳离子交换色谱(Hypersil SCX, 100 mm×4.6 mm I.D.)在pH 4.0的磷酸盐缓冲体系中分离, 洗脱产物进入切换接口, 样品组分被富集在捕集柱(Hypersil BDS C18, 15 mm×4.6 mm I.D.)中, 进一步脱盐后被导入第二维反相色谱(Hypersil BDS C18, 250 mm×4.6 mm I.D.)分离分析. 阳离子交换色谱采用逐步增加盐浓度的12步台阶等度间断方式洗脱, 每次将洗脱产物捕集在捕集柱中进而由反相色谱分析, 实现对第一维洗脱产物的切割转移及第二维分析. 与一维色谱相比, 二维液相色谱系统的分辨率、峰容量也得到提高, 系统峰容量达到2280.     

IEX/RP二维液相色谱中弱保留组分收集模式的构建及系统评价

以十通阀和捕集柱接口形式,构建了弱阴离子交换/反相(WAX/RP)二维液相色谱分离系统.通过将第一维离子交换色谱分析中的前部集中洗脱出的弱保留组分收集后单独分析,剩余样品进一步采用二维液相色谱分析,可以有效避免第二维色谱柱对特殊样品局部集中流出导致的第二维分离超柱容量问题,提高了系统的整体分离能力.使用4种蛋白胰蛋白酶酶解后的多肽样品评价该系统,在不分流的系统中共检测到115个峰.对第一维分离的前15 min分流后得到的组分单独分析,共识别出58个峰,后续的二维分离中共得到78个峰.2种方法相比,第二种方法检测峰数增加了21个,一些低丰度的组分在弱保留组分收集后被识别.     

离线二维液相色谱法分离巴天酸模根的化学成分

建立了离线二维反相/反相液相色谱分离体系（2D-RPLC/RPLC）,对巴天酸模中的化学成分进行分离。通过比较巴天酸模乙酸乙酯萃取液在环氧四氮唑和Unitary C18色谱柱上的高效液相色谱图,确定以环氧四氮唑色谱柱为第一维色谱柱,以Unitary C18色谱柱为第二维色谱柱。流动相均采用0.1%（v/v）甲酸水溶液和甲醇,梯度洗脱。经一维色谱分离后,共收集18个流分,采用二维色谱对这18个流分进行了进一步的分离分析。实验结果表明,该二维色谱分离方法高效、可行,为巴天酸模药材的微量组分的分离以及活性化合物的筛选提供了分离方法。     

凝胶过滤/离子交换全二维液相色谱系统的构建与评价

基于蛋白质的尺寸及带电性质,将凝胶过滤色谱(GFC)与离子交换色谱(IEC)两种分离模式结合,采用双捕集柱接口构建了GFC/2×IEC二维液相色谱(2-D LC)分离系统,同时考虑离子交换色谱分离蛋白质对等电点范围的限制,进一步结合中心切割平行柱的方法实现对蛋白质的全二维分离。为与后续蛋白质在线酶解、多肽分离及质谱鉴定匹配,系统中采用常规柱以保证蛋白质质谱鉴定对样品量的要求,3种常规分离柱分别选用凝胶过滤色谱柱TSK-GEL G3000SW_(XL)(300 mm×7.8 mm,5μm)、强阴离子交换色谱柱Hypersil SAX(100 mm×4.6 mm,10μm)和强阳离子交换色谱柱Hypersil SCX(100 mm×4.6 mm,10μm)。最终以酵母细胞蛋白质提取液为样品,对构建的二维系统加以评价,在总蛋白质浓度13.5 mg/mL、上样体积100μL的条件下,将第一维分离等时间切割17次,并将切割馏分全部导入第二维继续分离,二维系统在148 min内获得的总峰容量达到884。说明所构建的系统可以用于蛋白质的在线全二维分离。     

反相-高效液相色谱手性流动相添加剂法测定酸奶及含乳饮料中乳酸对映异构体

选取2,3,6-三甲基-β-环糊精（TM-β-CD）作为流动相手性添加剂,建立了采用反相高效液相色谱法分离酸奶及含乳饮料中乳酸异构体的方法。实验采用hypersil ODS2-C18（250×5．0mm,5μm）色谱柱,以0．5mmol／L PH2．5的TM-β-CD（含4．5mmol／L H2SO4）作为流动相,流速为1．0mL／min,紫外检测波长为210nm。实验考察了不同色谱柱、柱平衡时间、手性流动相添加剂浓度及pH值对分离效果的影响,并进一步研究了方法的线性范围、检出限、精密度及回收率。     

二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱法解析替考拉宁杂质

建立了二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱法（2D-UPLC-Q/TOF-MS）对替考拉宁组分分离和杂质结构解析的分析方法,有效地解决了流动相中含不挥发性磷酸盐的色谱系统不适用于液相色谱-质谱快速鉴定替考拉宁杂质的难题。一维超高效液相色谱以Octadecyl silica （ODS） hypersil色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）进行色谱分离,以3.0 g/L磷酸二氢钠溶液（pH 6.0）/乙腈=9/1 （v/v）为流动相A、3.0 g/L磷酸二氢钠溶液（pH 6.0）/乙腈=3/7 （v/v）为流动相B进行梯度洗脱;二维超高效液相色谱以Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（50 mm×2.1 mm, 1.7 μm）进行脱盐,以0.01 mol/L甲酸铵（pH 6.0）和乙腈为流动相进行梯度脱盐洗脱。质谱在电喷雾离子源、正离子模式下,采用全信息串联质谱（MS^E）模式采集质谱数据,锥孔气流速50 L/h,锥孔电压60 V,离子源温度120 ℃,雾化气流速900 L/h,雾化气温度500 ℃,毛细管电压2500 V,碰撞能量20~50 eV。根据杂质精确质量数及其二级质谱信息推导其结构,并对替考拉宁主要成分TA_2-2的裂解规律进行了推导,发现了2个母核特征离子;对《欧洲药典》10.0收录的10个组分及22个杂质组分进行二级质谱分析,发现了3个新杂质组分。采用该法既可以使用一维超高效液相色谱根据相对保留时间进行组分准确定位,也可以使用二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱二级质谱信息快速、简便、灵敏地对杂质进行结构鉴定,为替考拉宁的质量控制和工艺优化提供了一种新思路。