胍变及脲变α-淀粉酶的研究 Ⅰ.用高效疏水色谱法研究变性机理和复性效率

用疏水性强弱不同的两种色谱柱对７．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍及８．０ｍｏｌ／Ｌ脲变性的α－淀粉酶变体和在疏水色谱介质表面上折叠的中间体进行了分离和复性。通过研究和比较发现,两者的变性机理和形成折叠中间体的个数以及复性效率均不相同。在用疏水性较弱的疏水色谱柱对脲变α－淀粉酶的折叠中间体进行分离时,得到了疏水性接近连续的、数目很多的中间体。用疏水性较强的疏水色谱柱对胍变α－淀粉酶进行复性的效果较好。还研究了柱温变化对其折叠、分离效果和复性效率的影响。     

用高效疏水色谱法对多种脲变α—淀粉酶折叠中间体的研究

用高效疏水色谱法对用脲变性的α－淀粉酶的体外折叠中间体进行了分离，发现脲变α－淀粉酶折叠至少有１９个中间体，而且，这些中间体在色谱流出液中可稳定一周。这一结论已由电泳、离子交换色谱和体积排阻色谱法证实。此外，还用紫外吸收光谱和荧光发射光谱研究了这些折叠中间体与天然α－淀粉酶构象之间的差异。     

用高效疏水色谱法对多种脲变α-淀粉酶折叠中间体的研究

用高效疏水色谱法对用脲变性的α-淀粉酶的体外折叠中间体进行了分离，发现脲变α-淀粉酶折叠至少有19个中间体，而且，这些中间体在色谱流出液中可稳定一周．这一结论已由电泳、离子交换色谱和体积排阻色谱法证实．此外，还用紫外吸收光谱和荧光发射光谱研究了这些折叠中间体与天然α-淀粉酶构象之间的差异．     

固体表面特征对脲变α-糜蛋白酶折叠的贡献

以脲变α-糜蛋白酶(α-Chy)为模型蛋白, 用蛋白折叠液相色谱法研究了该蛋白在7种不同固体表面上的折叠及其在折叠过程中形成的中间体, 选用疏水相互作用色谱(HPHIC)固定相为吸附剂, 在动态条件下着重研究了疏水色谱固定相TSK和PEG-600表面对脲变α-Chy复性效率的贡献. 用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱对3.0 mol•L^－1脲变α-Chy, 在经 HPHIC柱复性并同时分离的收集组分进行确认后, 仅有一种稳定的脲变α-Chy折叠中间体. 发现PEG-600固定相表面较TSK固定相对α-Chy复性效果好. 证实了疏水性强度及固体表面配基的结构对蛋白折叠起着关键性的作用.     

用疏水色谱对还原型胍变性牛胰岛素的折叠特性研究

用疏水相互色谱(HPHIC)对还原胍变性牛胰岛素在疏水界面上的折叠与复性进行了研究.结果表明,采用普通流动相时,对还原胍变胰岛素的复性效果较差,而采用氧化型流动相可使其复性效率提高到66%,并用反相色谱(RPLC)、紫外吸收光谱、荧光光谱及MALDI-TOF对其复性效果进行了验证.同时与体积排阻色谱(SEC)和稀释法对还原胍变胰岛素的复性结果进行了比较.结果表明,SEC根本无法使还原胍变胰岛素复性,而稀释法的复性效率仅有2%.这进一步表明HPHIC是变性蛋白复性的有效工具,变性蛋白在疏水界面折叠过程中,蛋白质与固定相之间的疏水相互作用对蛋白折叠起着关键性的作用,是蛋白折叠的主要驱动力.     

HPHIC固定相对脲变α-糜蛋白酶复性的影响

依据计量置换保留理论所得到的参数lgI, 来测定不同构象态α-糜蛋白酶(α-Chy)在两种不同高效疏水相互作用色谱(HPHIC)固定相表面的折叠自由能, 发现脲变α-Chy在HPHIC固定相表面获取的折叠自由能比溶液中的高很多, 不同HPHIC固定相表面为脲变α-Chy提供不同的折叠自由能, 且都随变性剂脲浓度的增大而增大;通过对不同HPHIC色谱柱后复性α-Chy的比活测定, 还发现脲变α-Chy的复性效率与其从固定相表面的折叠自由能有关, 同一构象的α-Chy从固定相表面得到的折叠自由能越高越有利于其折叠成天然蛋白质.     

多方法组合分析脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶去折叠和重折叠过程的构象转化

以变性和非变性电泳、体积排阻色谱、内源荧光发射光谱、荧光相图、荧光猝灭以及活性测定等组合分析方法,研究了脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程。结果表明,在脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中,芽孢杆菌α-淀粉酶分子始终以单分子形式存在,不会形成分子间的聚集体或聚集体沉淀。当变性液或复性液中脲浓度约为4.0mol/L时,芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中均出现一个部分折叠中间体,两个过程均符合"三态模型"。脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子重折叠过程的复性曲线几乎与芽孢杆菌α-淀粉酶分子去折叠过程的残余活性率曲线重合。通过这些结果,并结合盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程,推断脲和盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程分别是相互可逆的。     

体积排阻色谱法研究变性溶菌酶分子复性过程中集聚体的形成

在体积排阻色谱柱上研究了还原剂存在时脲和盐酸胍变性的3种溶菌酶溶液的复性和分离过程。当变性液中原始溶菌酶浓度大于10 g/L时,变性溶菌酶在体积排阻色谱柱上除了复性为与未变性溶菌酶出峰时间相同的复性态溶菌酶分子外,还形成了溶菌酶折叠中间体的二分子集聚体。这个结果得到了用稀释法复性时溶菌酶的蛋白电泳检测结果的支持。与稀释法复性相比较,用体积排阻色谱法复性时所形成的折叠中间体二分子集聚体的量要远远低于用稀释法所形成的集聚体的量。     

荧光相图法研究猪胰腺α-淀粉酶在脲和盐酸胍溶液中的去折叠过程

用荧光相图法分别研究了脲和盐酸胍诱导的猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程。实验结果表明,当脲作为变性剂时,无论变性体系中有无还原剂2-巯基乙醇存在,猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程均只出现一个部分折叠中间体,符合“三态模型”;当盐酸胍作为变性剂时,若变性体系中存在还原剂2-巯基乙醇,猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程符合“三态模型”,而若变性体系中不存在还原剂2-巯基乙醇,猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程会出现两个部分折叠中间态,此过程符合“四态模型”。     

高效疏水作用色谱法对还原变性溶菌酶的折叠研究

首次用高效疏水相互作用色谱(HPHIC)研究了还原变性溶菌酶(Lys)的复性。对还原变性Lys在3种疏水性不同的色谱柱上的复性情况进行了考察,发现还原变性Lys在疏水性最弱的XDM-GM1型色谱柱上的复性效率最高,当Lys质量浓度为2.0 g/L时,其复性效率可达到94.6%。     

甲基膦酸二甲庚酯萃取色谱法分离金,铂的研究

本文研究了以４．０ｍｏｌ．Ｌ Ｈ２ＳＯ４－０．５０ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４为流动相，以硅烷化硅球负载的甲基膦酸二甲庚酯作固定相，萃取色谱法使微量铂，金与常见贱金属分离，富集在色谱柱上的铂和金分别用０．１０ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ和１．０％Ｎａ２ＳＯ３溶液洗脱进行连续分离与测定。经实际样品的试用考核，结果令人满意。     

还原变性核糖核酸酶在疏水性液-固界面上的复性

采用疏水相互作用色谱(HIC)对还原变性核糖核酸酶A (RNase A)在疏水性液-固界面上的复性进行了研究。详细讨论了流动相中脲的浓度、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)的比例、流动相pH和变性蛋白质浓度对还原变性RNase A复性效率和质量回收率的影响。结果表明,在最优化的复性条件(流动相中含有2.0 mol/L脲,GSH/GSSG的浓度比为8:1,流动相pH为8.0)下,还原变性RNase A能完全复性。当变性蛋白质质量浓度为5.0 mg/mL时,还原脲变性RNase A的活性回收率和质量回收率分别为98.0%和61.9%,还原胍变性RNase A分别为100.1%和66.8%。研究表明HIC是还原变性蛋白质复性的有力工具之一,可为蛋白质复性研究提供新方法和新思路。     

IDA型Cu~(2 )-螯合亲和膜色谱法对牛肝过氧化氢酶纯化的研究(英文)

首次采用以改性纤维素为基质、亚氨二乙酸（ＩＤＡ）为取代配基的铜离子螯合膜色谱法对牛肝过氧化氢酶（ＢＬＣ）的分离纯化进行了研究。缓冲液的ｐＨ值对ＢＬＣ与螯合配基的结合影响显著。在选定的色谱条件下，ＢＬＣ粗酶液经ＩＤＡ型Ｃｕ２＋－螯合膜色谱柱一步纯化，比活性平均提高４．７倍，回收率为６７．７％。金属螯合膜色谱柱可用含０．２ｍｏｌ／Ｌ的咪唑或５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ－１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的缓冲液再生，反复使用，后者比前者对柱子的再生效果更好。     

IDA型Cu~(2+):-螯合亲和膜色谱法对牛肝过氧化氢酶纯化的研究(英文):

首次采用以改性纤维素为基质、亚氨二乙酸（ＩＤＡ）为取代配基的铜离子螯合膜色谱法对牛肝过氧化氢酶（ＢＬＣ）的分离纯化进行了研究。缓冲液的ｐＨ值对ＢＬＣ与螯合配基的结合影响显著。在选定的色谱条件下,ＢＬＣ粗酶液经ＩＤＡ型Ｃｕ２＋－螯合膜色谱柱一步纯化,比活性平均提高４．７倍,回收率为６７．７％。金属螯合膜色谱柱可用含０．２ｍｏｌ／Ｌ的咪唑或５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ－１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ的缓冲液再生,反复使用,后者比前者对柱子的再生效果更好。     

用疏水色谱复性并同时纯化蛋白质的机理及其应用

变性蛋白表面的疏水氨基酸残基有与疏水色谱固定相(STHIC)颗粒相互作用的倾向, 两者之间的疏水相互作用能够抑制变性蛋白分子间的相互聚集. 同时疏水色谱固定相还能在分子水平上给变性蛋白分子提供足够高的能量, 使其瞬时脱水并折叠成其天然构象或不同的折叠中间体. 变性蛋白在疏水界面上的折叠不仅取决于其氨基酸之间的特异性相互作用及疏水色谱固定相的结构, 而且还取决于固定相和流动相之间的协同作用. 同时, 还提出了高效疏水相互色谱(HPHIC)进行蛋白折叠的机理及其进行蛋白折叠时能实现质量控制的原理. 在适当的色谱条件下, HPHIC 可使几种变性蛋白一步实现复性及同时纯化. 此外, 还设计制造出了直径比柱长大得多的实验室型和制备型“变性蛋白复性及同时纯化装置, USRPP”, 该“装置”具有完全除去变性剂、使蛋白质复性, 与杂蛋白分离及易于回收变性剂的“一石四鸟”功能. 该“装置”对变性蛋白的复性和纯化效率与通常使用的长柱相当. 在制备规模情况下, 该“装置”可以在低压梯度条件下简便、快速、而经济地应用于重组蛋白药物的制备. 文中以重组人干扰素-γ为例, 说明了制备型“装置”在其复性及同时纯化生产工艺中的应用.     

离子色谱法测定复杂氮硫化物

建立了复杂氮硫化物的离子色谱分析方法。在选定的色谱条件下能很好地分离多种高价及低价Ｎ－Ｓ化合物,尤其是能分析三价离子氨基三磺酸根。线性范围分别为：羟胺二磺酸根（０．０９８～６．９６０）×１０－４ｍｏｌ／Ｌ;氨基二磺酸根（０．１２５～１．５０９）×１０－４ｍｏｌ／Ｌ;氨基三磺酸根（０．３８０～３．０４６）×１０－４ｍｏｌ／Ｌ;羟胺一磺酸根（０．０２７～１．２４３）×１０－４ｍｏｌ／Ｌ;氨基一磺酸根（０．０１６～１．１６８）×１０－４ｍｏｌ／Ｌ。实验表明该法具有分析时间短、线性范围宽、灵敏和准确等优点     

反相离子对高效液相色谱法测定杀虫单

用反相离子对色谱法测定了杀虫单原粉中杀虫单的含量，色谱柱为Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ＯＤＳＩ ２５０ｍｍ·４．０ｍｍｉ．ｄ．５μｍ。流动相为０．０２５ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钾－０．００５ｍｏｌ／Ｌ四乙基溴倾铵，检测波长２４２ｎｍ，在上条件下，杀虫单原粉中杀虫单与杂质完全分离，方法操作简便，快速准确，可用于原粉中杀虫单的分析。     

精氨酸在苯甲醛存在下的吸附溶出伏安法研究

在０．２ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ－０．０４ｍｏｌ／ＬＨ３ＰＯ４－０．０２ｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４－０．０４ｍｏｌ／ＬＣＨ３ＣＯＯＨ溶液中，精氨酸（Ａｒｇ）在苯甲醛存在下产生一灵敏的吸附波。实验证明电活性物质为α－苯亚甲基精氨酸，其电极反应机理是分子内α－＞Ｃ＝Ｎ基团被还原为亚胺。用该吸附波可在１×１０（－３）～２×１０（－６）ｍｏｌ／Ｌ范围内分析蛋白质中的Ａｒｇ。     

枯草杆菌α－淀粉酶在色谱介质上的热变性行为研究

通过用前沿分析测定热力学参数的方法,研究了枯草杆菌α－淀粉酶在几种色谱介质上的热变性行为。实验结果表明,在RP-C18反相介质、Zn2+螯合的Chelating Sepharose Fast-Flow亲和介质和WCX-1阳离子交换介质上,当温度分别低于或超过30℃时,α－淀粉酶分子分别以一种稳定的构象存在;而在PEG-400 和修饰的PEG-400疏水色谱介质上,当温度分别低于40℃和30℃时,α－淀粉酶分子分别以一种稳定的构象存在,但当温度分别高于40℃和30℃时,α－淀粉酶分子的构象会发生剧烈的变化。同时,通过测定α－淀粉酶分子在自由溶液以及在PEG-400 和修饰的PEG-400疏水色谱介质上的热失活曲线,可以得出结论：在液相色谱过程中,色谱介质会诱导α－淀粉酶分子构象的变化,并促进它们的热变性;而在疏水色谱中,色谱介质的疏水性越高,α－淀粉酶分子在其上的构象变化温度越低。     

硝酸胍的单点滴定法快速分析

报道了以Ｓ－ 十二烷基双硫腙－ 苦味酸为载体制备苦味酸根离子电极, 研究了电极的性能, 并以该电极为指示电极研究了硝酸胍的单点滴定分析, 导出了定量关系式。 以０ ．１００ ０ ｍｏｌ／ Ｌ 标准硝酸胍溶液滴定０ ．１００ ０ ｍｏｌ／Ｌ 苦味酸, 控制滴定至９５ ％ ,１０ 次实验的平均值为０ ．１００ ２ ｍｏｌ／Ｌ, 相对标准偏差为０ ．２４ ％ , 滴定至９０％ ～９５ ％ 相对标准偏差小于０ ．３ ％ 。 用该法进行工业硝酸胍含量分析, 数分钟就能完成, 结果与重量法很好吻合。