用高效疏水色谱法对多种脲变α-淀粉酶折叠中间体的研究

用高效疏水色谱法对用脲变性的α-淀粉酶的体外折叠中间体进行了分离，发现脲变α-淀粉酶折叠至少有19个中间体，而且，这些中间体在色谱流出液中可稳定一周．这一结论已由电泳、离子交换色谱和体积排阻色谱法证实．此外，还用紫外吸收光谱和荧光发射光谱研究了这些折叠中间体与天然α-淀粉酶构象之间的差异．     

胍变及脲变α-淀粉酶的研究 Ⅰ.用高效疏水色谱法研究变性机理和复性效率

用疏水性强弱不同的两种色谱柱对７．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍及８．０ｍｏｌ／Ｌ脲变性的α－淀粉酶变体和在疏水色谱介质表面上折叠的中间体进行了分离和复性。通过研究和比较发现，两者的变性机理和形成折叠中间体的个数以及复性效率均不相同。在用疏水性较弱的疏水色谱柱对脲变α－淀粉酶的折叠中间体进行分离时，得到了疏水性接近连续的、数目很多的中间体。用疏水性较强的疏水色谱柱对胍变α－淀粉酶进行复性的效果较好。还研究了柱温变化对其折叠、分离效果和复性效率的影响。     

胍变及脲变α-淀粉酶的研究 Ⅰ.用高效疏水色谱法研究变性机理和复性效率

用疏水性强弱不同的两种色谱柱对７．０ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍及８．０ｍｏｌ／Ｌ脲变性的α－淀粉酶变体和在疏水色谱介质表面上折叠的中间体进行了分离和复性。通过研究和比较发现,两者的变性机理和形成折叠中间体的个数以及复性效率均不相同。在用疏水性较弱的疏水色谱柱对脲变α－淀粉酶的折叠中间体进行分离时,得到了疏水性接近连续的、数目很多的中间体。用疏水性较强的疏水色谱柱对胍变α－淀粉酶进行复性的效果较好。还研究了柱温变化对其折叠、分离效果和复性效率的影响。     

多方法组合分析脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶去折叠和重折叠过程的构象转化

以变性和非变性电泳、体积排阻色谱、内源荧光发射光谱、荧光相图、荧光猝灭以及活性测定等组合分析方法,研究了脲诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程。结果表明,在脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中,芽孢杆菌α-淀粉酶分子始终以单分子形式存在,不会形成分子间的聚集体或聚集体沉淀。当变性液或复性液中脲浓度约为4.0mol/L时,芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程中均出现一个部分折叠中间体,两个过程均符合"三态模型"。脲诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子重折叠过程的复性曲线几乎与芽孢杆菌α-淀粉酶分子去折叠过程的残余活性率曲线重合。通过这些结果,并结合盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程,推断脲和盐酸胍诱导的芽孢杆菌α-淀粉酶分子的去折叠和重折叠过程分别是相互可逆的。     

固体表面特征对脲变α-糜蛋白酶折叠的贡献

以脲变α-糜蛋白酶(α-Chy)为模型蛋白, 用蛋白折叠液相色谱法研究了该蛋白在7种不同固体表面上的折叠及其在折叠过程中形成的中间体, 选用疏水相互作用色谱(HPHIC)固定相为吸附剂, 在动态条件下着重研究了疏水色谱固定相TSK和PEG-600表面对脲变α-Chy复性效率的贡献. 用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱对3.0 mol•L^－1脲变α-Chy, 在经 HPHIC柱复性并同时分离的收集组分进行确认后, 仅有一种稳定的脲变α-Chy折叠中间体. 发现PEG-600固定相表面较TSK固定相对α-Chy复性效果好. 证实了疏水性强度及固体表面配基的结构对蛋白折叠起着关键性的作用.     

荧光相图法研究猪胰腺α-淀粉酶在脲和盐酸胍溶液中的去折叠过程

用荧光相图法分别研究了脲和盐酸胍诱导的猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程。实验结果表明,当脲作为变性剂时,无论变性体系中有无还原剂2-巯基乙醇存在,猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程均只出现一个部分折叠中间体,符合“三态模型”;当盐酸胍作为变性剂时,若变性体系中存在还原剂2-巯基乙醇,猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程符合“三态模型”,而若变性体系中不存在还原剂2-巯基乙醇,猪胰腺α-淀粉酶的去折叠过程会出现两个部分折叠中间态,此过程符合“四态模型”。     

HPHIC固定相对脲变α-糜蛋白酶复性的影响

依据计量置换保留理论所得到的参数lgI, 来测定不同构象态α-糜蛋白酶(α-Chy)在两种不同高效疏水相互作用色谱(HPHIC)固定相表面的折叠自由能, 发现脲变α-Chy在HPHIC固定相表面获取的折叠自由能比溶液中的高很多, 不同HPHIC固定相表面为脲变α-Chy提供不同的折叠自由能, 且都随变性剂脲浓度的增大而增大;通过对不同HPHIC色谱柱后复性α-Chy的比活测定, 还发现脲变α-Chy的复性效率与其从固定相表面的折叠自由能有关, 同一构象的α-Chy从固定相表面得到的折叠自由能越高越有利于其折叠成天然蛋白质.     

盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶去折叠过程的研究

分别用内源荧光光谱法、荧光相图法、荧光探针法、荧光猝灭法、蛋白质电泳法以及体积排阻色谱法研究了盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌a-淀粉酶的去折叠过程. 内源荧光光谱和荧光相图结果表明, 当变性液中盐酸胍浓度约为1.0 mol/L时, 芽孢杆菌a-淀粉酶的去折叠过程中出现一个部分折叠中间体, 其去折叠过程符合“三态模型”; 荧光探针结果表明, 在溶液中盐酸胍浓度约为1.0 mol/L时, 中间态芽孢杆菌a-淀粉酶分子中存在着能够与探针分子1-苯胺 基-8-萘磺酸(ANS)结合的稳定的疏水区域; 荧光猝灭研究给出了不同程度变性的淀粉液化芽孢杆菌a-淀粉酶中的Trp的分布情况, 结果表明中间态芽孢杆菌a-淀粉酶分子中能够被碘化钾猝灭的位于分子表面的色氨酸残基数目达到最大的8个; 蛋白电泳和体积排阻色谱结果表明, 在盐酸胍诱导的芽孢杆菌a-淀粉酶分子的整个去折叠过程中, 不会以共价键或非共价键形式形成芽孢杆菌a-淀粉酶分子之间的集聚体或集聚体沉淀. 在此基础上, 对盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌a-淀粉酶的去折叠过程进行了描述.     

体积排阻色谱法研究变性溶菌酶分子复性过程中集聚体的形成

在体积排阻色谱柱上研究了还原剂存在时脲和盐酸胍变性的3种溶菌酶溶液的复性和分离过程。当变性液中原始溶菌酶浓度大于10 g/L时,变性溶菌酶在体积排阻色谱柱上除了复性为与未变性溶菌酶出峰时间相同的复性态溶菌酶分子外,还形成了溶菌酶折叠中间体的二分子集聚体。这个结果得到了用稀释法复性时溶菌酶的蛋白电泳检测结果的支持。与稀释法复性相比较,用体积排阻色谱法复性时所形成的折叠中间体二分子集聚体的量要远远低于用稀释法所形成的集聚体的量。     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅴ去折叠过程的色谱分析

 将纯化的天然虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅴ经盐酸胍变性30 min后,在pH 3.0、反应温度为37 ℃的条件下与三羧甲基磷酸(TCEP)反应12 min,用反相高效液相色谱分离得到其全部去折叠中间体,通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行鉴定,并利用烷基化反应对这些去折叠中间体予以进一步确证。 根据其保留时间,分析虎纹毒素-Ⅴ各去折叠中间体的色谱行为,初步探讨了多肽或蛋白质构象异构体反相色谱行为的多样性。     

虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅴ去折叠过程的色谱分析

将纯化的天然虎纹捕鸟蛛毒素 Ⅴ经盐酸胍变性 30min后 ,在pH 3 0、反应温度为 37℃的条件下与三羧甲基磷酸 (TCEP)反应 12min ,用反相高效液相色谱分离得到其全部去折叠中间体 ,通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOFMS)进行鉴定 ,并利用烷基化反应对这些去折叠中间体予以进一步确证。根据其保留时间 ,分析虎纹毒素 Ⅴ各去折叠中间体的色谱行为 ,初步探讨了多肽或蛋白质构象异构体反相色谱行为的多样性。     

利用离子交换色谱快速纯化α－淀粉酶

 本文开发了一个用强阴离子高效液相色谱分离纯化α－淀粉酶的的新方法。详细讨论了纯比的最佳条件＊在给定的条件下纯化工业α－淀粉酶，其活性回收率达９６％，比活性为３８８ｕ／ｍｇ蛋白，纯化倍数提高３０倍，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，得到分子量分别为５８Ｋ和３３Ｋ两条α－淀粉酶谱带。此法纯化α－淀粉酶简单，快速，效率高。不仅能纯化工业粗酶，也可纯化其它来源的α－淀粉酶。     

枯草杆菌α－淀粉酶在色谱介质上的热变性行为研究

通过用前沿分析测定热力学参数的方法,研究了枯草杆菌α－淀粉酶在几种色谱介质上的热变性行为。实验结果表明,在RP-C18反相介质、Zn2+螯合的Chelating Sepharose Fast-Flow亲和介质和WCX-1阳离子交换介质上,当温度分别低于或超过30℃时,α－淀粉酶分子分别以一种稳定的构象存在;而在PEG-400 和修饰的PEG-400疏水色谱介质上,当温度分别低于40℃和30℃时,α－淀粉酶分子分别以一种稳定的构象存在,但当温度分别高于40℃和30℃时,α－淀粉酶分子的构象会发生剧烈的变化。同时,通过测定α－淀粉酶分子在自由溶液以及在PEG-400 和修饰的PEG-400疏水色谱介质上的热失活曲线,可以得出结论：在液相色谱过程中,色谱介质会诱导α－淀粉酶分子构象的变化,并促进它们的热变性;而在疏水色谱中,色谱介质的疏水性越高,α－淀粉酶分子在其上的构象变化温度越低。     

利用离子交换色谱快速纯化α－淀粉酶

本文开发了一个用强阴离子高效液相色谱分离纯化α－淀粉酶的的新方法。详细讨论了纯比的最佳条件＊在给定的条件下纯化工业α－淀粉酶，其活性回收率达９６％，比活性为３８８ｕ／ｍｇ蛋白，纯化倍数提高３０倍，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，得到分子量分别为５８Ｋ和３３Ｋ两条α－淀粉酶谱带。此法纯化α－淀粉酶简单，快速，效率高。不仅能纯化工业粗酶，也可纯化其它来源的α－淀粉酶。     

双水相萃取法从发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶的研究

以ＰＥＧ／硫酸铵双水相体系，经一次萃取从α－淀粉酶发酵液中分离提取α－淀粉酶和蛋白酶。萃取最适宜的条件为１５％ＰＥＧ１０００、２０％（ＮＨ４）２ＳＯ４，ｐＨ＝８，α－淀粉酶收率９０％，分配系数为１９．６；与蛋白酶的分离系数高达１５．１，比活率为原发酵液的１．５倍，蛋白酶在水相中的收率高于６０％。本文对反萃取条件进行了初步研究。与传统的提取法相比，本法可直接处理发酵粗滤液，提高工效，降低能耗和酶活损     

蛋白折叠液相色谱法复性和纯化大肠杆菌表达的重组人粒细胞集落刺激因子

用蛋白折叠液相色谱法(PFLC)对大肠杆菌表达的包涵体形式的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)进行了复性并同时纯化。用Cu2+-亚氨基二乙酸（IDA） Sepharose作为固定化金属离子亲和色谱的固定相。在低浓度脲存在下,以咪唑为洗脱剂,采用线性梯度洗脱rhG-CSF。该法仅通过一步PFLC分离,减少了复性过程中rhG-CSF的聚集,复性后的rhG-CSF的比活性为1.8×108 IU/mg,纯度为97%,质量回收率为32%。     

地衣芽孢杆菌A.4041耐高温α-淀粉酶热稳定性及构象研究

近年来，对耐热酶特别是耐高温淀粉酶的研究十分活跃［１～３］，地衣芽孢杆菌Ａ．４０４１是我国自行诱变的耐高温α－淀粉酶的生产菌株［４］．为了探索耐热酶的热稳定机理和规律，本文采用荧光光谱和圆二色谱法对地衣芽孢杆菌Ａ．４０４１耐高温α－淀粉酶α－Ⅲ纯酶组...     

利用色谱法研究α—淀粉酶变性动力学

提出用尺寸排阻色谱法研究酶的变性动力学。此法将高效色谱分离同灵敏的紫外检测结合起来，消除了紫外法测定蛋白质变性速度时变性体的影响。确定了α－淀粉酶在盐酸胍溶液中变性时的反应级数。测定了不同浓度变性剂中酶的变性速度常数，并和答活速度常数进行了比较，讨论了影响酶变性速度的因素。     

四氢糠醇对α-胰凝乳蛋白酶在液相色谱中复性效率的影响

用高效疏水相互作用色谱（HPHIC）研究了将四氢糠醇加入盐酸胍（GuHCl)变性剂中或将四氢糠醇键合至硅胶基质时，对α－胰凝乳蛋白酶（α-Chy)复性效率的影响情况，并以α－Chy的生物活性回收率对结果进行了表征。用尺寸排阻色谱（SEG）与HPHIC的实验结果进行了比较，结果表明，四氢糠醇在变性剂中和键合至硅胶上时，均可提高α－Chy的复性效率，但提高的程度不同。四氢糠醇在溶液中或在HPHIC固定相表面时具有辅助α－Chy进行复性作用的机理可能是由于四氢糠醇与α－Chy形成了复合物的形式。实验中还对GuHCl中加入的四氢糠醇量进行了优化。     

旋光性除草剂敌草强分析方法的研究

报道了旋光性除草剂敌草强光学纯度的分析方法。（１）将原料中间体（±）－湿基酸和Ｒ（－）和Ｓ（＋）－湿基酸分别与Ｓ（－）－α－甲基苄胺反应，制备成非对映衍生物，再用高效液相色谱测定Ｒ（－）和Ｓ（＋）光学异构体的相对纯度；（２）用旋光仪测定Ｒ（－）－敌草强的光学纯度；（３）用高效液相色谱法测定敌草强的化学含量。经（２）、（３）方法综合校正后，计算出Ｒ（－）－敌草强的真正含量。