基于磷酸化组蛋白H2AX的酶联免疫检测方法评价卷烟烟气基因毒性

基于酶联免疫原理,建立了定量测定细胞中磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)含量的新方法,并用于评价卷烟烟气的基因毒性。采用不同剂量的烟气气相物与烟气粒相物暴露于中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞),通过测定不同染毒时间下细胞中γH2AX含量水平变化,考察烟气染毒与细胞DNA损伤的剂量效应关系,以及不同烟气组分基因毒性的差异。此外,通过定量监测细胞中活性氧的变化,探讨卷烟烟气暴露诱发细胞DNA双链断裂损伤的作用机理。结果表明,随烟气暴露时间的增加,细胞中γH2AX的含量在几小时内达到峰值,然后逐渐下降;染毒浓度越高,细胞中γH2AX含量达到峰值的时间越长;随着烟气粒相物或气相物染毒浓度的增高,细胞中γH2AX含量水平呈上升趋势;烟气粒相物染毒相比烟气气相物对细胞中γH2AX含量的影响更为显著;此外,烟气成分直接染毒会引起细胞内活性氧的含量增加。细胞内活性氧的含量变化与细胞DNA双链断裂标志物γH2AX的含量变化有较强相关性,卷烟烟气中自由基成分可能是诱发细胞DNA双链断裂的原因之一。     

介孔氧化钛对多磷酸化肽段的高灵敏度分析

蛋白质的磷酸化修饰广泛存在于细胞生命活动进程中,在细胞的分化、繁殖、代谢及信号转导等方面均发挥着重要作用.MALDI-TOF-MS技术因其高灵敏度等优点,已成为蛋白质研究的重要分析工具之一.由于磷酸化蛋白的天然丰度和离子化效率较低、检测信号被抑制等缺点,因此需要发展新的分析方法以提高其分析灵敏度和选择性.本文建立了基于介孔氧化钛的多磷酸化肽段高效分析方法,同时利用了TiO2对磷酸化肽的选择性吸附作用和介孔材料特殊空间结构所形成的对多磷酸肽的动力学及热力学吸附效应,结合MALDI-TOF-MS技术,成功地实现了对混合溶液中多磷酸化肽的选择性富集和高灵敏度分析鉴定,与其他方法相比,分析性能得到明显的提高,可实现对低量磷酸化肽段的识别与检测.     

电化学检测磷酸化多肽的研究

建立了一种非探针标记型磷酸化多肽的电化学检测方法,该方法以N,N-二(羧甲基)-L-赖氨酸(Lys-NTA)和Fe3+修饰的金电极作为磷酸化多肽的捕获和传感界面,利用磷酸化多肽能够与之形成金属离子螯合物而发生特异性结合并引起电极表面修饰层通透性改变等特点,采用铁氰化钾作为电化学指示剂,用循环伏安法和交流阻抗法对磷酸化多...     

磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展

蛋白质的磷酸化是一种可逆性的翻译后修饰,在细胞的增值、分化、信号转导以及转录与翻译调控、蛋白质复合体的形成、蛋白质降解等方面发挥着极为重要的作用.因此磷酸化蛋白的鉴定成为翻译后修饰研究的重要内容.但由于磷酸化蛋白的丰度较低, 难以用质谱直接检测.为了解决这个问题,改善质谱对磷酸肽的信号响应, 需要对磷酸化蛋白质或磷酸肽进行富集.本文系统地介绍了磷酸化蛋白组学研究中应用较为广泛和最新建立的各种分离富集方法的原理、特点、应用研究进展,包括抗体富集法、激酶特异富集法、亲和富集法、化学修饰法、多种色谱分离富集方法以及MALDI靶盘富集法.     

新型反相/强阴离子交换混合模式材料用于磷酸化肽富集

建立了新型反相/强阴离子交换混合模式材料(C18/SAX)的磷酸化肽富集方法.考察了流动相组成(乙腈浓度、甲酸浓度、缓冲盐浓度)对酪蛋白(α-Casein)酶解液中磷酸化肽分离选择性的影响.实验结果表明,磷酸化肽在C18/SAX上的保留行为受疏水和离子交换作用力的共同调控,单磷酸化肽先于多磷酸化肽从材料上洗脱出来.随着甲酸浓度增加,磷酸化肽的保留减弱;随着盐浓度增加,磷酸化肽保留变小.采用优化后的流动相,建立以20％ ACN/20 mmol/L NH4Ac作为上样溶液,20％ ACN/0.1％ FA和50％ ACN/100 mmol/L NH4Ac/2％ FA分别作为洗脱液分段洗脱单、多磷酸化肽的方法.以α-Casein和人血清白蛋白(HSA)酶解液的混合溶液(1∶20,n/n)作为模拟样品,实现了单、多磷酸化肽的同时富集和分段洗脱,分别检测到4条单磷酸化肽和14条多磷酸化肽的信号.将本方法用于牛奶中的磷酸化肽检测,共鉴定到4条单磷酸化肽和8条多磷酸化肽信号.结果表明,本富集方法选择性高,有良好的应用前景.     

二氧化钛结合超滤膜富集和分离肿瘤患者唾液中的磷酸化肽和唾液酸化糖肽

利用TiO2富集、超滤膜滤过实现了选择性富集和分离磷酸化肽和含唾液酸的N-链接糖肽.首先选取截留分子量为1×104的超滤膜分离糖肽和磷酸化肽,然后利用酪蛋白和牛血清白蛋白的酶解物验证所建立的方法,该方法的最低检出限是0.16 pmol.将上述方法应用于肺癌患者的唾液检测,成功检测并鉴定到8个磷酸化肽和5个糖肽.本方法可有效提高磷酸化肽和糖肽检测的选择性和灵敏度,为疾病生物标志物的检测提供了新方法.     

胶束电动毛细管色谱分离氨基酸和磷酸化氨基酸

本文报道了胶束电动毛细管色谱分离、汞灯诱导荧光电荷耦合器件检测分析氨基酸和磷酸化氨基酸的 4-氟 - 7-硝基苯 - 2 - 口恶 - 1 ,3-丫唑衍生物。研究表明 ,在 p H9.35的 1 0 mmol/L硼砂和 1 0 mmol/L十二烷基硫酸钠的电泳缓冲介质中 ,5种氨基酸和 3种磷酸化氨基酸在 1 0 min内完全分离 ,检测灵敏度为 1 .2 1× 1 0 - 8～ 5 .2 1×1 0 - 8mol/L ,分离效率达 7.3× 1 0 5～ 3.0× 1 0 5/m理论塔板数 ,结果令人满意     

磷酸化肽富集新方法研究进展

对组成复杂的生物样品中的低丰度磷酸化肽进行预富集,能够消除高丰度非磷酸化肽等干扰组分,从而提高磷酸化肽在质谱分析中的灵敏度,获得更好的检出和鉴定结果.在磷酸化肽富集过程中,对磷酸化肽具有选择性亲和作用的富集材料是实现对磷酸化肽特异高效富集的关键,多种具有不同类型亲和作用的富集材料已在磷酸化肽富集研究中得到了应用;而在材料形貌、富集操作形式、磷酸化肽富集特异性等方面,研究者们也不断在现有磷酸化肽富集材料的基础上进行多样化的改进.本文分别从不同类型亲和作用的磷酸化肽富集材料以及磷酸化肽富集方法改进两方面,对近年来磷酸化肽富集方法的研究进展进行了评述.     

多金属氧酸盐/壳聚糖磁性复合材料的制备及其用于磷酸化肽的富集

建立了一种基于多金属氧酸盐磁性材料富集磷酸化肽的方法。采用层层自组装技术制备多金属氧酸盐/壳聚糖磁性材料,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测手段,用于磷酸化肽的富集。该磁性材料具有快速磁响应、亲水性、正电性等优点,对磷酸化肽具有高的富集选择性。实验用β-酪蛋白作为模型蛋白质,通过富集后,方法的检出限为0.02 fmol,说明合成的磁性材料对微量蛋白样品分析具有很高的应用潜力。     

血清磷酸化肽的分离富集和质谱定量及其作为潜在肿瘤标志物的评价

血清中磷酸化肽种类和浓度的变化既能反映人体内蛋白质水解酶活性的变化,又能反映蛋白质翻译后磷酸化的水平,业已成为肿瘤标志物寻找和发现的重要目标。因而,血清中磷酸化肽的鉴定及其定量分析在具有临床应用价值的肿瘤标志物的筛选与发现中起着重要作用。由于血清中的内源性磷酸化肽丰度极低,在质谱分析中的离子化效率不高,且受到来自高丰度非磷酸化肽和蛋白质的信号抑制及干扰,血清中磷酸化肽的质谱定量分析是分析化学研究中的一个巨大挑战。文章对血清磷酸化肽的分离富集、质谱定量分析及其作为肿瘤标志物的筛选和评价等3个方面的研究进展进行总结、评述,并展望该领域的未来研究趋势和应用前景。     

季铵化磁性壳聚糖复合材料对磷酸化肽的富集研究

蛋白质磷酸化是最重要和最普遍的翻译后修饰之一,蛋白质磷酸化的测定对于全面了解生物过程中的磷酸化途径至关重要。质谱技术是分析蛋白质磷酸化的重要手段,但磷酸化肽固有的低丰度、低电离效率以及与非磷酸化肽共存等特性严重影响质谱对其进行直接分析。为解决此问题,需在质谱分析前对磷酸化肽进行选择性富集。本研究制备了一种基于季铵化磁性壳聚糖的复合材料用于磷酸化肽的富集。此磁性材料具有快速的磁响应性、良好的生物相容性、正电性以及廉价易得等优点。采用β-酪蛋白作为模型蛋白质,结果表明此材料对磷酸化肽具有良好的富集选择性。经过富集后,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）检测手段,方法的检出限为0.4 fmol。本方法被成功用于脱脂牛奶中磷酸化肽的检测,表明其对复杂样品中磷酸化肽的富集和检测具有良好的应用潜力。     

蛋白质磷酸化位点富集与鉴定方法的建立与应用

建立了一种用Ti O2填料,自制色谱小柱,从而实现磷酸化肽段富集的方法,填料负载量可根据需求调整等优势。质谱分析显示,Ti O2小柱可以实现标准磷酸化蛋白质修饰位点的识别,针对alpha-casein的分析显示,结合液相色谱串联质谱鉴定,可以获得15个磷酸化修饰位点。方法用于突触核蛋白(α-synuclein)磷酸化修饰位点的鉴定,确认了数据库中的S87,T125 2个修饰位点,同时发现了11个新的修饰位点。有望促进磷酸化蛋白质质谱分析技术在基础与临床研究实验室的推广应用。     

功能化磁性纳米材料在磷酸化肽富集中的应用

蛋白质磷酸化是最重要和最普遍的翻译后修饰之一。基于质谱的技术已成为分析蛋白质磷酸化的重要手段。然而,磷酸化肽固有的低丰度和电离效率以及由非磷酸化肽共存引起的严重抑制使得直接质谱分析仍然是一个挑战。为解决此问题,需在质谱分析前对磷酸化蛋白质进行选择性富集。磁性纳米材料具有良好的磁响应性,可以在外界磁铁的帮助下实现与溶液的迅速分离。功能化磁性纳米材料作为一种新型的分析技术已在蛋白质组学研究中得到广泛的应用。该文就近年来对磁性纳米粒子进行各种功能化修饰以提高其特异性吸附能力的吸附材料在磷酸化肽的富集方面的应用予以综述,并展望了功能化磁性纳米材料在磷酸化肽富集领域的应用前景。     

EMMPRIN磷酸化突变质粒的构建及功能检测

利用聚合酶链式反应(PCR)定点诱变技术,对细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)的2个磷酸化位点进行突变,构建了EMMPRIN磷酸化位点突变质粒.对其功能进行检测发现,EMMPRIN磷酸化位点突变质粒可在细胞内正常表达.研究结果显示,突变质粒可抑制肿瘤细胞的增殖(P<0.05),表明EMMPRIN可能与肿瘤细胞的增殖相关.     

纳升级电喷雾离子源-四极杆-飞行时间质谱中磷酸化肽的离子抑制作用

目前磷酸化蛋白质组学研究中的主要技术是蛋白质酶解产生的磷酸化肽的质谱检测。但是实际样品中的磷酸化肽(特别是多磷酸化肽)很难被检测到。其原因普遍认为是由于质谱检测时,非磷酸化肽抑制磷酸化肽。但也有认为非磷酸化肽对磷酸化肽没有抑制作用。另外磷酸化肽之间是否存在离子抑制作用还没有报道。本文采用相同氨基酸序列的标准磷酸化肽和非磷酸化肽,将其单独和混合进行质谱检测,通过对比混合前后磷酸化肽的信号强度,证明了非磷酸化肽对磷酸化肽有离子抑制作用;单磷酸化肽对二磷酸化肽有一定的抑制作用,但不太显著;单磷酸化肽对三磷酸化肽、二磷酸化肽对三磷酸化肽均有显著的离子抑制作用。该研究为今后单磷酸化肽和多磷酸化肽的分段富集和检测提供了有力的证明。     

等电聚焦分离与18O稳定同位素标记联用的磷酸化蛋白质组学定量方法研究

磷酸化蛋白质组学定量分析,要对磷酸化修饰富集技术和定量技术进行研究。基于此,本研究采用18O稳定同位素标记技术对胰蛋白酶酶解肽段混合物进行标记,并对其标记时间和标记后胰蛋白酶的变性条件进行优化。结果表明:在pH=4～5的KH2PO4缓冲体系中,37℃,标记反应持续19～24h,除了C-端肽之外,几乎所有的肽段都可达到100%标记;采用TCEP可以有效地抑制16O-18O回标现象。建立了与18O标记技术兼容性良好的IPG-IEF技术对磷酸化肽段进行选择性富集,富集后共从HepG2细胞中鉴定到491个磷酸化位点、362个磷酸化肽段和356个磷酸化蛋白,表明IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离富集中是有效的;最后与高准确度高灵敏度高分辨率的LTQ-FTICR质谱仪联用,建立了基于18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白质组定量技术。实验结果表明,该技术可以实现磷酸化肽段的有效定性和定量。本研究为磷酸化蛋白质组学定量研究提供了实用技术。     

纳米材料在蛋白磷酸化分析中的应用研究

蛋白质磷酸化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,在细胞代谢过程中发挥着重要作用。当蛋白质的正常磷酸化调节发生异常时,会导致癌症、糖尿病、心脏病等各种疾病的发生。因此,蛋白磷酸化分析对于疾病的早期快速诊断、药物筛选和治疗等方面具有重大的意义。由于蛋白质磷酸化过程是动态的,并且磷酸化肽段或蛋白在生物样品中的含量较低,因此高灵敏的蛋白磷酸化分析面临着巨大的挑战。该文依据在检测过程中,选择性识别或捕获磷酸化的肽段或蛋白的主要机理,综述了近几年纳米材料对磷酸化肽段的富集和信号放大作用在蛋白磷酸化分析中的研究进展,并对其未来研究方向进行了展望。     

核苷及其类似物的三磷酸化方法研究进展

三磷酸核苷是一种具有三个磷酸基团的核苷酸,不仅在细胞的能量代谢中起着重要作用,也可用于心脑血管和神经系统等许多疾病的治疗和辅助治疗,随着分子生物学的发展,三磷酸核苷在许多生物检测技术中也应用广泛。新冠疫情爆发以来,抗病毒核苷类药物成为研究的热点,这类药物大多在体外不具有活性,而是在细胞内代谢为三磷酸形式发挥作用,在对这类化合物的抗病毒机理研究中,研究其抗病毒活性、抗病毒机制等都需要将核苷类药物进行三磷酸化,因此开发一种高效的核苷三磷酸化方法是十分必要的。本文根据三磷酸核苷的合成历史进程,综述了迄今为止三磷酸核苷的化学合成方案。旨在为核苷及其类似物的三磷酸化以及相关药物的研发提供参考。     

混合模式色谱材料Click TE-GSH高效富集多磷酸化肽

多磷酸蛋白对于生物体适应内外环境具有重要意义,而明确多磷酸蛋白的磷酸位点功能及其信号转导机制尤为关键. 复杂生物样品中多磷酸化肽的低丰度、低电离的特性,以及非磷酸化肽的抑制作用,决定了质谱分析前进行多磷酸化肽富集是非常必要的步骤. 本工作采用基于巯基-烯烃点击化学法合成的混合模式材料Click TE-GSH进行单磷酸化肽和多磷酸化肽的选择性富集. 我们建立了单磷酸化肽、双磷酸化肽和多磷酸化肽的顺序分段富集方法. 该优化方法能抗干扰,应用于脱脂牛奶时富集到11条多磷酸化肽. 与商品化固化金属亲和色谱(IMAC)材料相比,Click TE-GSH富集多磷酸化肽的选择性更好. 本工作所建立的富集方法为高效富集多磷酸化肽提供新方法和新技术.     

质谱法分析大肠癌组织中踝蛋白的磷酸化修饰

踝蛋白的磷酸化修饰,特别是肿瘤等病理条件下的踝蛋白磷酸化状态,与肿瘤的发病、转移机理密切相关。本研究采用盐析、离子交换层析和电泳分离并纯化了人大肠癌组织中的踝蛋白(Talin),经胰酶水解获得其肽段混合物,进一步分别利用固定化Fe3+亲和层析和TiO2亲和层析在酸性条件下对其中磷酸化修饰肽段进行吸附,并以1%氨水进行洗脱。在Michrom Magic C18色谱柱上,以A:99%水+1%乙腈+0.1%甲酸和B:99%乙腈+1%水+0.1%甲酸两种流动相进行梯度洗脱分离,采用ESI质谱进行依赖数据的二级子离子扫描。结果显示,固定化Fe3+富集到8个磷酸化肽段而TiO2富集到9个磷酸化肽段。本研究提供了一种快速、准确地鉴定从人大肠癌组织中分离表征踝蛋白的方法。