人工合成的酵母丙氨酸转移核糖核酸的生物活力测定

本文报道了用一种高灵敏度的方法测定人工合成的酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的生物活力。tRNA_y~(Ala)在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下接受丙氨酸后,用操作简便而回收率较高的酒精沉淀法回收氨酰化产物,最后,在兔网织红细胞裂解液无细胞蛋白合成体系中,测定氨酰化产物中的丙氨酸转移到蛋白质中去的能力——参入活力。这方法不仅可以测定分离纯化的tRNA_y~(Ala)的活力,而且也可以测定经T_4RNA连接酶连接两个半分子后的反应混合物中产物tRNA_y~(Ala)的活力。利用这方法,已成功地测定了微至5—7 pmoles的人工全合成tRNA_y~(Ala)的接受活力和参入活力两组数据。测定结果表明,全合成tRNA_y~(Ala)的接受活力是天然分子的51.6—65.6％,是经拆合的天然分子的91.3—106.0％。其氨酰化产物中的[~3H]-Ala在兔网织红细胞裂解液中的利用率为61.6—63.1％,是天然分子的90.6—91.7％,是经拆合的天然分子的97.2—115.8％。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子(36—76)的合成

本文报告用T_4RNA连接酶将相应于酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))3′-半分子(36—76)的三个寡核昔酸大片段——10(36—45)(Ⅰ),12(46—57)(Ⅱ)和19p(58—76)(Ⅲ)——从3′-端向5′-端延伸逐个连接合成了这个tRNA的3′-半分子(36—76)。首先在供受体配比为1:1.5的情况下,采取三步连续反应,即19p(Ⅲ)的5′-磷酸化,然后与12(Ⅱ)的连接和连接反应产物的5′-磷酸化等反应,一次制备分离的方法,以70％的总得率合成了5′-磷酸化的三十一核苷酸(46—76)(Ⅳ)。然后,以(Ⅳ)作为下一步反应的供体和三倍量的10(Ⅰ)连接,以67％的产率合成了具有四十一核苷酸的tRNA_y~(Ala)的3′-半分子(36—76)(Ⅴ)。将这个合成的3′-半分子,5′-磷酸化以后,与天然的5′-半分子连接,人工半合成了tRNA_y~(Ala)整分子,经生物活力测定,这个人工半合成的tRNA_y~(Ala)具有接受[~3H]-丙氨酸、并能将接受的丙氨酸转移到蛋白质分子中去的生物活力。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子(1—35)的合成

本文报道了应用T_4RNA连接酶将酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))5′-半分子中的三个寡核苷酸片段[—13(Ⅰ);14—22(Ⅱ);23—35(Ⅲ)]连接成5′-半分子的工作。由于寡核苦酸片段的纯度高,多核苷酸激酶和T_4RNA连接酶的质量好,采用连续反应的方法,简化了分离步骤,使产物的得率大大提高,二十二核苷酸的连接率是75％,三十五核苦酸的连接率是90％,以第一步反应原料为基数计算,最终产物的总得率是21％。经连接点和末端核苷酸分析,证明它的结构是正确的。将合成的5′-半分子与天然的3′-半分子在T_4RNA连接酶的催化下连接成人工半合成的完整tRNA_y~(Ala),具有接受[~3H]-丙氨酸和将[~3H]-丙氨酸转移到蛋白质中的生物活力。     

修饰核苷酸的生物功能——Ⅱ.酵母tRNA~(Ala)类似物(A_(34)或G_(34)代替I_(34))的合成及生物活性

酵母tRNA~(Ala)的5′-半分子类似物(A_(34)或G_(34)代替I_(34))与3′-半分子在T_4 RNA连接酶催化下连接成酵母tRNA~(Ala)类似物(A_(34)或G_(34)代替I_(34))的整分子。合成的酵母tRNA~(Ala)类似物,在凝胶电泳上具有与天然酵母tRNA~(Ala)相同长度位置,其纯度为95％左右,连接点、末端分析都是对的。测定了这类似物的生物活力,即在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下,接受丙氨酸的能力与天然重组的酵母tRNA~(Ala)没有明显变化,而在兔网织细胞裂解液体系中能将所携带的丙氨酸参入到蛋白质中去的能力,A_(34)代替I_(34)的只有天然或天然重组酵母tRNA~(Ala)的1/3,而G_(34)代替I_(34)的为90％左右。着重讨论了A或G代替I_(34)后,参入活力变化不同的原因。     

生物化学家王德宝教授

酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_Y~(Ala))的人工全合成获得了1987年国家自然科学一等奖。用人工方法合成重要的生物大分子(蛋白质、RNA 和 DNA)是人类合成生命的前提,也是验证这些化合物结构的最好方法。由于生     

酵母丙氨酸转移核糖核酸双氢尿核苷(D)环区九核苷酸(14-22)的合成

用有机合成或酶促合成的AGDCGG为受体,以过量的pDAGp为供体,应用T_4RNA连接酶,成功地合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的双氢尿核苷(D)环区九核苷九磷酸AGDCGGDAGp.在脱去3’-端磷酸基团后,得九核苷八磷酸.产物经序列分析证明,与AGDCGGDAG完全符合.本文也进行了相应于D环区九核苷酸的组成片段AG,AGDC,GG,GGp和DAG的5’-磷酸化和它们之间连接的条件探索,发现了3’-DMP和DAG的5’-磷酸化需在5～10℃下进行,可获近定量的产率. AGDCGGDAGp已用于tRNA_y~(Ala)的全分子合成.     

核酸化学研究 Ⅴ.修饰的核苷酸和寡核苷酸的合成

本文叙述的修饰核苷酸——假尿嘧啶核苷酸的合成以及它和胸腺嘧啶核苷酸的保护,酵母丙氨酸转移核糖核酸TψC臂中CpCpGpG和TpψpCpG的合成.CpCpGpG和TpψpCpG均已圆满地用于t-RNA_y~(Ala)的3'-半分子合成和整分子的全合成.     

tRNA分子中修饰核苷酸的生物功能——Ⅲ.酵母tRNA类似物(A_(37),G_(37)或C_(37)代替m~1I_(37))的合成及生物活性

本文报道用牛脾磷酸二酯酶在控制条件下制备了去除37位m~(?)I的酵母丙氨酸tRNA3′-半分子(38—76核苷酸)。合成了由普通碱基A,G或C代替m~(?)I_(37)的酵母丙氨酸tRNA类似物。并测定了这些类似物的生物活性,结果表明与天然的酵母丙氨酸tRNA相比,这些类似物在鼠肝tRNA合成酶系统中接受丙氮酸的活力不受影响,而在兔网织蛋白质合成系统中携带丙氨酸参入蛋白质的活力却下降为天然tRNA的20—30％,对上述结果及牛脾磷酸二酯酶的作用条件进行了讨论。     

酵母丙氨酸tRNA类似物的合成及其生物活力的测定

在体外系统中,T 7-RNA聚合酶转录编码酵母丙氨酸tRNA及其半分子的DNA,获得不含修饰核苷酸的酵母丙氨酸tRNA及其5’半分子(1-35位核苷酸)和3'半分子(37-75位核苷酸).在T4-RNA连接酶的催化下,不含修饰核苷酸的5'半分子(1-35位核苷酸)和3'半分子(37-75位核苷酸)分别与天然的3'半分子(36-75位核苷酸)和5'半分子(1-36位核苷酸)连接成tRNA类似物.用以上方法得到了酵母丙氨酸tRNA的3个类似物:(1)tRNA的5'半分子不含修饰核苷酸;(2)tRNA的3'半分子不含修饰核苷酸;(3)整个tRNA分子不含有修饰核苷酸.在鼠肝氨酰tRNA合成酶系统中测定tRNA接受丙氨酸的活力,在兔网质无细胞蛋白质合成系统中测定tRNA将丙氨酸参入蛋白质的活力.结果是:5'半分子不含修饰核苷酸者,其接受丙氨酸的活力降低52％,而参入丙氨酸的活力基本不变;3'半分子不含修饰核苷酸者,其接受丙氨酸的活力降低79％,参入活力降低57％;整个分子不含修饰核苷酸者接受丙氨酸的活力降低85％,参入活力降低47％.这些结果说明修饰核苷酸,尤其是3'半分子的修饰核苷酸与tRNA的接受活力和参入活力间有密切的关系.     

核酸化学研究V.修饰的核苷酸和寡核苷酸的合成

本文叙述的修饰核苷酸-假尿嘧啶核苷酸的合成以及它的胸腺嘧啶核昔酸的保护,酵母丙氨酸转移核糖核酸TΨC臂中CpCpGpG和TpΨpCpG的合成.CpCpGpG和TpΨpCpG均已圆满地用于t-RNA~Y^Ala的3'-半分子合成和整分子的全合成.     

Ⅴ.结晶胰岛素的全合成

牛胰岛素的全合成工作是在天然胰岛素的两条链重组合成功,并获得重合成的结晶胰岛素;以及人工合成的A及B链分别与天然胰岛素的B及A链组合成功,并分别获得半合成结晶胰岛素的基础上进行的。我们自1964年第一次获得具有生物活力的全合成产物以来,在工作中不断实践,不断总     

(—)-Isochaetominine推测结构的对映选择性全合成与结构修正

报道生物碱isochaetominine推测结构8的对映选择性全合成与结构修正.采用立体多样性合成策略,通过L-色氨酸与L-丙氨酸苄酯组合,以DMDO氧化启动的串联反应为关键反应,经5步高效地完成了isochaetominine推测结构8及其立体异构体(+)-2,3,14-tri-epi-chaetominine(12)的全合成.基于本实验室此前有关毛壳菌素(1)立体多样性合成的工作,天然isochaetominine的结构修正为(-)-11-epi-chaetominine(18).我们此前已完成了该天然产物的首次对映选择性全合成(从L-色氨酸出发,5步,总产率31.6%).此外,通过研究色氨酸与缬氨酸叔丁酯组合,建立了isochaetominine C三个非对映立体异构体的立体多样性合成.最后,证实了化合物13B无法进行C(14)位定点差向异构化,但可以进行C(11)和C(14)双差向异构化.     

天花粉胰蛋白酶抑制剂及其类似物的全合成

天花粉胰蛋白酶抑制剂(Trichosanthes trypsin inhibitor, TTI)是一含27个氨基酸残基的多肽,其中包括三对硫硫键。本文报道了它的化学全合成及其分子内二硫键重组,合成产物纯化后其氨基酸序列以及与胰蛋白酶的抑制当量比均与天然抑制剂相一致。并合成了此抑制剂的类似物,其N端第6位Met残基由Ala所取代,合成产物纯化后,其抑制活力也与天然抑制剂相同。此结果为今后天花粉胰蛋白酶抑制剂作为融合蛋白用基因工程表达以及产物的后处理提供了依据。     

具有合成核酸活性的多肽 Ⅰ.C-端去四肽和去六肽核糖核酸酶A及其水解和合成活性

核糖核酸酶A(RNase A)的结构与功能的关系虽属已知,但大都限于水解作用方面,而关于合成作用方面的报道则颇少.根据前人用抑制剂法所得羧甲基化核糖核酸酶A的衍生物(CM-RNase A),和用合成法所得分子较简单的RNase A的类似物的研究结果,似乎RNaseA分子中的His_(119)与Lys_(41)残基与酶的合成活性无关.这些衍生物和类似物的合成活性都比它们的水解活性高,但不论它们的合成或水解活性都很显著地低于天然酶的活     

修饰核糖核酸酶A的酶促合成模型研究

为研究Leu¹²¹-核糖核酸酶A(Leu¹²¹-RNaseA)的半合成制备了C-端去HAsp Ala SerValOH四肽核糖核酸酶A即RNase A(1—120),用固相合成法合成了C-端四肽的类似物HLeu Ala Ser Val OH及C¹⁴标记Leu(记为Leu^*)的四肽HLeu^* Ala Ser Val OH。在设计的小肤模型中,以Boc Val Phe OH和HLeu Ala OMe为底物,在含50%乙二醇,pH 4.50的醋酸缓冲溶液中,在胃蛋白酶的作用下成功地得到了四肤Boc Val Phe Leu Ala OMe,并研究了温度对宵蛋白酶酶促反应的影响。在RNase A(1-120)与H Leu Ala Ser Val OH四肤的胃蛋白酶酶促反应的初步研究中,用HPL C检测反应出现一个新峰。此峰的保留时间与预期产物的保留时间相一致。同位素标记酶促合成试验在高压纸电泳上出现一个新的同位素点,估计为预期的产物。本文还对酶促合成的一些问题进行了讨论。     

我国人工合成酵母丙氨酸转移核糖核酸获得成功

去年十一月,我国胜利地完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的合成。这是世界上第一次人工合成了一个具有明确生物活力的核糖核酸,是继我国在世界上首     

新型鹅去氧胆酸分子裂缝的设计合成

分子识别是生物体系的基本特征,并在生命活动中起中心作用。生物酶高效专一地催化生化反应,抗体与抗原的结合,蛋白质分子与DNA序列的相互作用等都源于精确的分子识别[1,2]。利用合成的人工受体与适当底物之间的分子识别以建立仿生仿酶模型的研究,已成为生物有机化学前沿富有挑战性的领域。分子裂缝作为一类新型的人工受体,以其灵活的结构以及易于将功能团聚集在受体与底物结合的活性部位上等优点,引起了人们的广泛关注[3-5]。胆甾因其具有刚性的凹面结构和天然的手性,是构筑分子裂缝人工受体的理想结构单元。我们曾报道3α-OH和7α-OH同…     

黄酮苷的合成研究进展

黄酮苷广泛存在于自然界植物,具有广泛的药理活性和潜在的药用价值,其合成方法值得研究,对2014年至2018年黄酮苷的合成进行综述.黄酮苷的合成主要包括化学合成和生物合成两大类,而化学合成又分为全合成和半合成,其中全合成主要有β-丙二酮酸化关环法(Baker-Venkataraman,BK-VK法)和查尔酮氧化关环法(Algar-FlynnOyamada, AFO法)两种经典方法;半合成是以芦丁、槲皮素、山萘酚、柚皮素等天然黄酮为原料.黄酮氧苷的化学合成目前常用的方法有三种:Koening-Knorr法、相转移催化法、糖基三氯乙酰亚胺酯法.黄酮碳苷的糖苷链的连接主要是通过O→C重排法.酶催化生物合成法目前常用的酶是糖基转移酶和糖苷合酶这两种酶.     

四种天然二聚二苯乙烯类化合物的全合成研究

天然二聚二苯乙烯类化合物大都具有显著和广泛的生物活性,如Shegansu B(1),Gnetuhainin F(2),Maackin A(3)和Cassigarol E(4)等.此类化合物的全合成研究尚未见文献报道.我们小组以HRP/H2O2酶催化氧化为关键步骤,首次完成了(±)-1～4四种天然二聚二苯乙烯类化合物的全合成,合成路线如图所示:     

碱基腺嘌呤与多肽酰胺间氢键作用的最佳位点

正确理解核酸碱基和蛋白质多肽间的作用机制有助于人们利用这些生物分子有效地进行分子设计,进而制备具有特殊纳米结构和功能的生物分子材料.本文优化得到了碱基腺嘌呤与N-甲基乙酰胺、甘氨酸二肽、丙氨酸二肽形成的20个氢键复合物的结构并计算了结合能,探讨了腺嘌呤与多肽酰胺间氢键作用的最佳位点.研究发现:腺嘌呤可以使用两个不同位点(A1位点和A2位点)与N-甲基乙酰胺形成N―H…N型或者N―H…O=C型氢键复合物,腺嘌呤使用A1位点与N-甲基乙酰胺形成的N―H…N型氢键复合物更稳定;二肽分子可以使用主链上两个不同位点(丙氨酸的Ala7位点和Ala5位点或者甘氨酸的Gly7位点和Gly5位点)与腺嘌呤形成含有N―H…N和N―H…O=C两条氢键的复合物,二肽分子使用Ala7或Gly7位点与腺嘌呤形成的氢键复合物更稳定;腺嘌呤与多肽间的氢键作用强于其与N-甲基乙酰胺的作用.基于分子中的原子理论与自然键轨道计算结果分析了氢键作用的本质.