动力学因素对液相色谱分离整体蛋白的影响

依据液相色谱分离整体蛋白的效果与色谱柱柱长基本无关的事实,研究了动力学因素对疏水相互作用色谱(HIC)分离整体蛋白的影响。首次提出了用于线性梯度洗脱条件下蛋白分离的“条件板高”(H)概念,并将其用于动力学因素对分离整体蛋白的影响的表征。分别用常用的色谱柱和色谱饼对标准蛋白进行了分离,绘制了类似于van Deemter的“条件板高”对流动相线速(u)的曲线图。发现对应于色谱柱最低“条件板高”的适合线速约为色谱饼的1/5～1/15,且色谱饼的适合线速范围也较色谱柱宽得多。据此,用装填有HIC填料的色谱饼(10 mm×20 mm i.d.)在12 min内便可完全分离7种标准蛋白。还用装填有HIC填料的色谱饼对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)进行了复性并同时纯化,在50 min内,仅用一步色谱法就可获得纯度≥97%的rhG-CSF,其质量回收率为39%,比活＞1×108 IU/mg。可以预计,装填极细颗粒的刚性色谱填料的色谱饼可在高负荷条件下进行整体蛋白的高速和高分离度的分离、纯化并同时复性,达到“三高”。     

高效液相色谱法制备罗汉果甜甙Ⅴ标准品

为深入研究罗汉果中功能成分的药理药效,进一步开发罗汉果中的有效成分,将罗汉果鲜果的水提物以AB 8吸附树脂分离、D 280离子交换树脂脱色后,利用半制备高效液相色谱法得到三萜皂甙类化合物罗汉果甜甙Ⅴ标准品,纯度达98 5%。色谱柱为AlltechEconosphereNH2柱;流动相为乙腈 水(体积比为68∶32)溶液,流速5mL/min;检测波长203nm;柱温40℃。此方法具有操作简便、重现性好、产品纯度高等优点。     

10°锥角台锥型制备液相色谱柱的放大研究

将10°锥角台锥型液相色谱柱放大至150mm长、入口直径54mm、出口直径27mm,容积为200mL,填料为粒径40～75μm、孔径11nm的C18球形硅胶。流动相在锥型柱内呈现塞子状流形。系统地评价了该柱的分离性能,结果表明：在最佳流速为6mL/min时,以萘峰计,锥型柱的折合理论塔板高度为2.11,柱效下降10%时的样品质量和体积载样量分别为2.1mg和1.7mL,与同长度同体积圆柱型柱相比,柱效提高了20%,质量载样量提高了16%以上,体积载样量提高了19%以上。当进样质量由2.4mg增加到12mg时,对羟基苯甲酸乙酯峰与对羟基苯甲酸丁酯峰的分离度（Rs2）由2.14降到1.71,对羟基苯甲酸丁酯峰与萘峰的分离度（Rs3）由2.91降到2.52;当进样体积由3mL增加到19mL,Rs2由2.23降到1.28,Rs3由2.95降到2.30,但此时的色谱峰峰形仍然高度对称,没有拖尾,有利于从基质中制备分离微量组分。实验结果表明锥型液相色谱柱将具有广泛的应用前景。     

高效液相色谱法制备罗汉果甜甙Ⅴ标准品

 为深入研究罗汉果中功能成分的药理药效,进一步开发罗汉果中的有效成分,将罗汉果鲜果的水提物以AB-8吸附树脂分离、D-280离子交换树脂脱色后,利用半制备高效液相色谱法得到三萜皂甙类化合物 罗汉果甜甙Ⅴ标准品,纯度达98.5%。色谱柱为Alltech Econosphere NH2柱;流动相为乙腈-水(体积比为68∶32)溶液,流速5 mL/min ;检测波长203 nm;柱温40 ℃。此方法具有操作简便、重现性好、产品纯度高等优点。     

生物大分子液相色谱分离中色谱柱长与柱径比的优化研究

用厚度为 1cm、而直径不同的色谱饼 (或饼形色谱柱 )对 7种蛋白质进行了色谱谱分离 ,得出了柱长与柱径比对生物大分子分离度影响不大的结论。还对柱内腔几何体积相同、而柱长 柱径比不同的色谱柱和色谱饼对分离度的影响以及它们压力降作了比较 ,结果表明色谱饼可在几乎不降低分离度的前提下显著降低色谱系统的压力。通过对 1 0× 5 0mmI.D .色谱饼体积和质量负载量以及质量回收率的测定 ,表明色谱饼对生物大分子的分离已达到制备规模。     

10°锥角台锥型制备液相色谱柱的放大研究

将10° 锥角台锥型液相色谱柱放大至150 mm长、入口直径54 mm、出口直径27 mm,容积为200 mL,填料为粒径40～75 μm、孔径11 nm的C18球形硅胶。流动相在锥型柱内呈现塞子状流形。系统地评价了该柱的分离性能,结果表明: 在最佳流速为6 mL/min时,以萘峰计,锥型柱的折合理论塔板高度为2.11,柱效下降10%时的样品质量和体积载样量分别为2.1 mg和1.7 mL,与同长度同体积圆柱型柱相比,柱效提高了20%,质量载样量提高了16%以上,体积载样量提高了19%以上。当进样质量由2.4 mg增加到12 mg时,对羟基苯甲酸乙酯峰与对羟基苯甲酸丁酯峰的分离度(Rs2)由2.14降到1.71,对羟基苯甲酸丁酯峰与萘峰的分离度(Rs3)由2.91降到2.52;当进样体积由3 mL增加到19 mL,Rs2由2.23降到1.28,Rs3由2.95降到2.30,但此时的色谱峰峰形仍然高度对称,没有拖尾,有利于从基质中制备分离微量组分。实验结果表明锥型液相色谱柱将具有广泛的应用前景。     

一种金属螯合连续棒色谱柱的制备及色谱性能

金属螯合色谱（IMAC）在生物大分子的分离和纯化中有广泛的应用,通过改变IMAC的洗脱条件和被螯合的金属离子种类,生物大分子可获得选择性分离。目前,IMAC通常以有机和无机微球作固定相,由于柱死体积的存在,使色谱柱空间利用率低,且降低了蛋白质分离的柱效。近年报道的连续棒色谱柱是由直径1μm左右的微粒堆积而成的整体,消除了色谱柱的死体积,该类色谱柱用于蛋白的反相、疏水、离子交换和亲和色谱分离均可获得高的分离效率。然而,至今尚未见到对金属螯合连续棒色谱柱制备及应用的研究报道。对蛋白的IMAC分离机理研究中,研究流动相pH对分离的影响是主要手段之一,但通常研究的pH值的5.0-9.0的窄范围内。本文提出和制备了以交联聚甲基丙烯酸缩水甘油酯连续棒为基质的金属螯合色谱柱,并研究了pH在2.0-11.0的较宽范围内对蛋白保留的影响。     

女贞子中红景天苷的HPLC制备分离

研究了制备型高效液相色谱分离纯化女贞子中红景天苷的方法。制备色谱的参数为:色谱柱为C18柱(50 mm×200 mm,5μm),流动相为甲醇-水(体积比为7.5∶92.5),流速100 mL·min-1,二级管阵列检测器在278 nm检测,进样体积为2.2 mL。在18 min的运行时间内,红景天苷与干扰成分得到很好的分离,经HPLC检测纯度均达到98%以上。此方法具有快速高效、分离组分纯度高的特点,可用于制备红景天苷。     

填充条件对半制备柱性能影响的机理研究

对稀匀浆法填充半制备柱(Ф10 mm×100 mm)的过程进行研究,并用正交法对柱填充条件进行了优化,考察了压力、匀浆液组成、匀浆液体积对半制备柱填充效果的影响.由柱效和分离度定义式中的参数入手,讨论填充条件对柱性能的影响.通过计算总孔隙率ε_t、内部孔隙率ε_p、外部孔隙率ε_e、Van-Deemter曲线、吸附等温线等参数,发现填充压力对填充密度的作用最大,是最重要的影响因素;匀浆配比和匀浆体积共同影响其填充的均匀性.在压力11 MPa,流速275 mL/min,120 mL纯乙醇为匀浆液的条件下得到了最好的填充效果.     

用于蛋白同时复性及纯化的制备型装置中流动相用量的优化研究

 在生物大分子的高效液相色谱分离中 ,由计量置换保留模型可得出生物大分子在色谱柱上的保留行为取决于流动相中置换剂的浓度的结论。据此提出了用于蛋白同时复性及纯化的制备型装置 (USRPP)中最小流动相用量的估算公式 ,并进一步得出在保持最小流动相用量不变的条件下 ,改变流动相流速和线性梯度时间几乎不影响制备型USRPP分离蛋白的分离度和复性效率的结论。该结论与实验结果一致。     

分析型色谱饼对人血清白蛋白的快速纯化

采用分析型色谱饼对标准蛋白混合物进行了分离,结果表明装填有小颗粒填料的色谱饼在高流速条件下仍然具有良好的分离能力。在较大流速(5 mL/min)条件下,在10 min内对人血清白蛋白样品进行了快速纯化,其纯化后的人血清白蛋白的纯度大于85%,回收率为65%,说明分析型色谱饼可以用于快速分离纯化生物大分子。     

台锥形柱尾的填充毛细管液相色谱柱

首次将台锥形柱尾用于填充毛细管液相色谱柱,并与环氧胶粘的柱尾连接方式进行比较,发现在柱内径≥０．３２ｍｍ时,前者的柱效比后者高出３０％～５０％,且明显改善柱效－流速特性。对比研究了不同内径柱（０．５３ｍｍ,０．３２ｍｍ,０．２５ｍｍ）采用两种尾接方式的塔板高度与流速的关系,对产生差异的原因进行了探讨。     

不锈钢宽口径填充毛细管液相色谱柱

 设计了一种零死体积的二通式柱尾结构和一种使匀浆填料均匀进入色谱柱管内的储料池 ,研究了制备内径在 0 5mm～ 1 0mm的不锈钢宽口径填充毛细管液相色谱柱的方法。详述了以不同牌号、规格的反相ODS类固定相制备的不同柱长的色谱柱的性能。通过折合板高 /折合流速关系和不对称因子对柱性能进行了评价 ,结果表明 ,该方法制备的色谱柱柱效达到理论值的 75 %以上、RSD为 6% ,稳定性也很好。将其应用于抗癫痫药物和氯苯类化合物的分析 ,结果令人满意。     

正常拖尾色谱峰的塔板模型表达式

得到了描述正常拖尾色谱峰的塔板模型表达式,根据这一表达式,正常的色谱流出曲线应是非对称的拖尾峰,而对称的高斯型分布函数是对塔板模型进行近似处理的结果。和扩散模型的色谱流出曲线方程相比,二者在形式上完全相同,因此,尽管塔板模型和扩散模型的机理不同,但它们对于色谱流出曲线的数学描述是完全相同的。     

宽口径填充毛细管液相色谱柱柱尾结构的改进

 设计并评价了尾锥形填充毛细管液相色谱柱,与粘结型柱尾比较,前者柱效高且van Deemter曲线高流速部分的流速-柱效关系明显改善。在折合流速为10～15时,前者的柱效比后者高出30%～50%。谱带的抛物线状的流形在尾锥形柱内得到改善,使色谱峰的对称性有明显提高。比较了两种结构的色谱柱在芳烃快速分析中的分离效果,结果是尾锥形柱的分离性能优于粘结型柱。     

锆基色谱填料的制备方法和物理化学性质

氧化锆基质色谱填料适合于碱性物质,特别是生物大分子的分离,因而具有良好的应用前景。它的制备方法对其物理化学性质有很大的影响,从而影响填料的色谱性能。该文对氧化锆微球的制备方法及其物理化学性质进行了综述。分析表明,目前氧化锆基质色谱填料的制备方法存在着难以克服的缺点,要制备理想的锆基色谱填料需要新的思路。     

三步柱色谱法从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化类凝血酶

建立了一种用CM Sepharose CL-6B阳离子交换、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换和Sephadex G-75凝胶排阻三步柱色谱从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化类凝血酶的方法。在实验室小柱分离方案的基础上,对该纯化工艺进行了放大。当上样量达实验室小柱的25倍时,所得类凝血酶的质量指标与实验室小柱基本一致。采用该法所得的蝮蛇类凝血酶经Shim-pack Diol-300高效凝胶排阻柱测得其相对分子质量约为33500,用Shim-pack VP-ODS反相色谱柱检测其纯度约为96%。从江浙粗蛇毒中提取类凝血酶时,类凝血酶的总质量收率约为0.3%,总活性收率约为64%,比活可达2000 U/mg。     

以万古霉素为流动相添加剂的高效液相色谱法手性分析系统的建立

以丹酰化苯甘氨酸、丹酰化苯丙氨酸、丹酰化丝氨酸、丹酯化丙氨酸为模型化合物，通过对色谱柱类型、缓冲液类型、pH和盐浓度、万古霉素用量、甲醇用量、柱温等色谱参数进行考察，建立了以万古霉素为手性流动相添加剂在普通色谱柱上进行手性分析的色谱系统，并在该系统中成功地拆分了酮洛芬对映体。     

应用电子计算机求解色谱过程动力学方程

提出采用计算机求取色谱过程动力学方程解的方法。在此基础上考察了在Ｌａｎｇｍｕｉｒ吸附等温线情况下色谱柱效率、色谱峰的偏态、峰态与分酸系数、流动相线速、进样量之间的关系,从而明确指出,动力学过程是使色谱峰峰形拖尾的一个原因,但不是主要原因。实践中观察到的峰非对称性现象主要是分配系数非线性所致。