指数线性聚合酶链式反应法制备焦磷酸测序反应的单链模板

建立了一种简单的焦磷酸测序用单链模板制备方法,以包含SNP6位点一段78bp序列为对象,采用非热启动Taq酶进行指数线性PCR扩增,通过加入甘油、BSA等PCR增强剂增加反应的效率和特异性,设计反应液A和B处理PCR产物中干扰焦测序的限制性引物、未完全反应的产物、焦磷酸和dNTPs等杂质, 处理后1～2 μL PCR产物就可直接用于焦测序检测.测定了BRCA1基因中5个乳腺癌相关的SNP位点,获得的图谱无非特异性信号,测得序列与参考序列一致,能够进行SNP分析,表明本方法可以制备高质量焦测序单链模板,且使焦测序的成本显著降低,操作更为简便,减少了操作过程中样本间的交叉污染,有利于焦测序样品预处理的自动化.     

碱基序列标记法结合焦磷酸测序测定不同来源基因表达量

建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称"SRPP").先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签,PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码,使得测序结果中的序列代表基因的来源,峰高代表基因在不同来源中的相对表达量.用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证,结果表明,SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量,并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异.     

焦测序技术及其在遗传分析中的应用

焦测序技术是一种新的实时DNA测序技术。它在DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,使引物延伸聚合脱氧核糖核酸(dNTP)释放焦磷酸盐(PP i)、PP i转换三磷酸腺苷(ATP)、ATP产生荧光信号与dNTP和ATP的降解等化学反应偶联起来,检测结果准确可靠。本文综述了焦测序技术的基本原理、操作步骤和它在单核苷酸多态性(SNP)研究、微生物的分型鉴定和基因甲基化检测等遗传分析中的应用,并对焦测序技术的发展作了展望。     

全血改进线性指数聚合酶链式反应用于焦磷酸测序检测基因多态性

焦磷酸测序是目前基因多态性检测的主要方法之一,但是其前期的样本制备工作较为繁琐,限制了其在临床检测中的应用。为了简化焦磷酸测序的流程,本研究根据不对称PCR原理,改进了线性指数聚合酶链式反应(LATE-PCR)的引物设计方法,增加过量引物的长度和浓度,并结合全血直接扩增技术,建立了基于普通r Taq聚合酶和高p H缓冲液(Hp H Buffer)的全血改进LATE-PCR(Improved LATE-PCR,im LATE-PCR)方法。考察了方法的最优扩增体系、血液抗凝剂对其影响以及全血模板量。采用单管、一步法直接扩增出单链测序模板,成功地对24例临床血样的乙醇脱氢酶基因多态性进行了检测,检测结果可用于指导临床个体化用药。24例样本的基因型分别为ADH1B位点AA纯合6例、AG杂合14例、GG纯合4例;ADH1C位点GG纯合20例、AG杂合4例、AA纯合0例。     

基于克隆测序技术的人类白细胞抗原基因高分辨率分型方法的建立

运用优化的扩增和克隆测序技术,建立了人类白细胞抗原( HLA-B)基因的高分辨率分型方法。针对HLA-B基因保守区序列设计引物进行等位基因扩增,基于质粒不相容原理将杂合型等位基因有效克隆入质粒DNA中,经细菌培养后进行Sanger测序,根据测序结果经ClustalX2软件分析和IMTG/HLA数据库的BLAST比对即可完成HLA-B基因的高分辨率分型。利用建立的方法对7例临床样本进行了HLA-B基因分型,并且与第三方直接碱基序列分析基因分型技术( PCR-SBT)进行比对,结果完全一致。本方法无需专业分型软件,准确度高,成本低;采用通用引物进行等位基因的扩增和测序,无需传统方法中繁琐的引物设计和过程优化,实现了HLA-B基因的高分辨率分型。     

复合式蝎形引物实时定量检测端粒酶延伸产物

针对端粒酶延伸产物中靶基因序列的特殊性,开发了一种可产生荧光的复合式蝎形引物,该引物的5'端带有可特异性检测靶基因的探针序列,PCR阻断剂将其与引物序列连接.当复合式蝎形引物延伸,探针序列与同一分子内的靶基因杂交,荧光信号产生.运用该技术,建立了定量检测端粒酶延伸产物的实时荧光PCR方法.该法可在快速PCR循环条件下,对0.15～1.50×10³ amol/μL范围内的样品进行定量检测,线性相关系数R²=0.9992.该法操作简便,无需PCR后额外的检测步骤.     

微流控芯片电泳-多重聚合酶链反应法同时测定多个单碱基多态性位点

以微流控芯片电泳为检测平台,建立了多重PCR扩增法同时测定多个单碱基多态性(SNP)位点的方法。先通过PCR扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;用限制性内切酶消化成短片段,再将酶切反应产物与脱氧核糖核酸适配器(DNAadapter)相连;以连接产物为模板,分成两管,分别用n条等位基因特异性引物和一条通用引物进行n重PCR扩增;最后用微流控芯片电泳法分离PCR扩增产物,根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。以细胞色素P4502D6(CYP2D6)基因中的5个SNP位点(100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T)为检测对象,考察了各等位基因特异性引物之间的相互影响和扩增反应的特异性,采用微流控芯片电泳法成功测定了20名健康中国人的CYP2D6基因中5个SNP位点的基因多态性,与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)测定结果完全一致。     

焦测序法检测禽流感病毒

以焦测序技术为检测平台,在研究禽流感病毒基因特性的基础上,建立一种检测禽流感病毒及确定其是否为高致病性禽流感病毒的序列测定法。首先,选择一段保守的M基因序列及一段包含裂解位点的HA基因序列为研究对象,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增技术初步判断其是否为禽流感病毒及病毒亚型;然后采用焦测序法检测目的片段序列;最后,对焦测序法检测序列进行分析,从基因序列上判断其是否为禽流感病毒,并进一步判断病毒的亚型以及是否为高致病性禽流感病毒。研究结果表明,当焦测序反应中三磷酸酰苷双磷酸酶(Apyrase)的浓度为1.6U/mL时,能有效抑制错误信号的产生;当Klenow的浓度为90U/mL时,可读序列长度为33个碱基。采用优化的焦测序反应体系测定了4个样本,其中1个样本被判断为H5N1亚型禽流感病毒,具有潜在的高致病性;另外3个样本为H9N2型禽流感病毒,具有低致病性。本方法具有准确、快速和实时检测等优点。     

基于引物延伸反应进行SNP基因分型的电化学方法

引物延伸反应的高特异性使其成为单核苷酸多态性(SNP)基因分型的最常用方法. 本文利用引物延伸反应, 通过二茂铁标记的dUTP将二茂铁引入到延伸的产物中, 用一条捕获探针将延伸产物捕获到电极表面, 用差分脉冲伏安法对电极表面的二茂铁进行检测, 从而实现了SNP基因分型. 考察了延伸反应的退火温度、聚合酶用量以及DNA杂交温度等因素的影响. 应用该方法对β-地中海贫血基因密码子28位单碱基突变进行检测, 获得了满意的基因分型结果. 该方法检测限可达到0.86 fmol/L, 是一种简便、快速且灵敏的SNP分型方法.     

应用PCR扩增牛SRY序列进行奶牛胚胎性别鉴定

本工作通过对牛SRY的直接测序,设计出牛SRY特异PCR引物,并应用PCR扩增奶牛胚胎的SRY特异序列来鉴定胚胎性别,经胚胎移植证实胚胎性别鉴定结果正确。     

单碱基多样性的非测序检测

单碱基多样性（SNP）是最常见的基因突变形式之一,经研究证明与很多疾病相关。虽然测序是检测SNP的重要方法,但其需要检测仪器,且检测时间较长,限制了其临床应用。本文综述了SNP的常见非测序分析方法。首先讨论了检测的热力学问题,并归纳了主要的检测策略：基于杂交的检测,基于链取代反应的检测和酶介导的检测。在三维均相检测方法中,主要介绍了不同信号开关策略,如荧光开关、酶识别开关和场效应开关。三维原位检测不仅能检测SNP,还能提供其细胞定位信息,在细胞异质性较高时更具优势。二维界面检测的识别反应速率和杂交效率受到一定影响,但界面检测能进一步减小干扰,亦便于实现高通量检测。以DNA正四面体探针界面为代表的改良界面具有优良的灵敏度和特异性。同时本文亦讨论了现有方法的局限性,并对SNP非测序检测研究进行展望。     

基于石墨烯纳米材料的DNA测序研究进展

设计和研发快速、准确、价廉、高通量的DNA测序方法,对于预防早期疾病和了解相关疾病机理具有非常重要的意义。新型纳米材料石墨烯由于具有独特的结构和性质,在化学和生物科学等领域发挥着重要的作用。该文介绍了DNA测序的研究现状以及应用石墨烯纳米材料的优势,重点阐述了DNA链通过石墨烯纳米孔、石墨烯纳米间隙、石墨烯纳米带时产生不同的电流信号识别碱基序列的原理,同时介绍了DNA链与石墨烯的相互作用对DNA测序的影响,并对DNA测序的研究方向进行了展望。该文为基于石墨烯纳米材料的DNA测序提供了作用原理、理论研究以及检测方法等参考。     

急性淋巴细胞白血病中T细胞受体γ基因V-J结合部顺序的研究

本文应用T细胞受体γ基因的V_γ和J_γ引物对一组急性淋巴细胞白血病(ALL)标本进行了DNA多聚酶链反应(PCR)的研究,应用不对称PCR以及DNA直接测序方法检测了18个中国人ALL细胞的TCR_γ基因V-J结合部区域(N顺序),在中国人ALL中首次证明了TCR_γ基因的N顺序确实是克隆特异的。进一步,依据已经测序的N顺序,我们合成了几个白血病克隆特异的寡核苷酸作为探针,对4例ALL进行了微小残余病变(MRD)的研究,显示该方法的灵敏度为0.1—0.01％。     

全血直接扩增结合焦磷酸测序法测定亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性

亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C>T和1298A>C两个位点的多态性与临床常用抗肿瘤药物甲氨喋呤及氟尿嘧啶的作用密切相关,对这两个位点多态性的检测能指导临床合理用药。为进一步缩短检测时间,降低检测成本,本研究建立了基于全血直接PCR的焦测序检测方法,采用"HpH Buffer"直接扩增全血模板,仅需1μL全血样本即可对两个位点进行高效扩增。扩增产物经碱变性法制备单链模板后进行焦磷酸测序,经过条件优化,仅需5μL扩增产物和1μL微球即可完成高灵敏的焦测序反应。为验证方法的准确性,检测了12例临床样本,均能正确检测两个位点的基因多态性。本研究为临床基因多态性检测提供了一种操作简便,耗时短,成本低,准确度高的方法,本方法可用于指导甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶的个体化用药。     

热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用

新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序。实验结果表明:突变后的荧光素酶在50℃环境中仍具有活性;在43℃下10min活性保留大于80%,热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明,荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。     

一种基于磁性颗粒和通用连接子扩增技术的单核苷酸多态性分型方法

提出了一种应用磁性颗粒和通用连接子扩增技术(Linker-PCR)的多位点单核苷酸多态性(SNP)分型方法. 该方法首先通过酶切将样本基因组DNA打断, 然后将通用连接子通过T4 DNA连接酶与各个酶切片段连接, 利用生物素标记的通用引物将样本进行全基因组扩增. 扩增后, 将生物素标记的Linker-PCR扩增产物固定到亲合素修饰的磁性颗粒表面, 通过与双色荧光标记的等位基因特异性探针杂交, 对待测位点进行分型. 利用该方法, 我们对10个样本MTHFR基因上的2个SNP位点进行了分型, 分型结果准确、正错配信号比大于3. 由于利用Linker-PCR技术来实现对靶序列的全基因组扩增, 该方法非常适用于大量样本的多基因多位点的SNP分型研究.     

双链特异性核酸酶的生物学和医学应用

双链特异性核酸酶DSN是一种能高选择性地识别并酶切完全匹配的DNA双链或者DNA-RNA杂交双链中的DNA,而对单链DNA和RNA几乎没有作用的核酸酶.DSN酶的上述特点使其在生物和医学等领域广泛应用,主要包括全长cDNA文库的均一化、单核苷酸多态性(SNP)检测和高通量测序等.近年来,DSN酶在microRNAs(miRNAs)的检测领域得以长足发展和应用.miRNAs是一组内源性、非编码短序列RNAs,在生理和病理过程中具有重要作用,但由于其序列短、丰度低等特点, miRNAs的检测一直是临床难题.新近研究主要基于DSN酶信号放大的特点,相继建立了一系列生物传感技术,通过采用不同检测原理如比色法、荧光法、电化学法等实现痕量miRNAs检测.本文就DSN酶在miRNAs检测、SNP检测、全长cDNA文库均一化及高通量测序等方面的生物学应用进行了综述.     

五引物单管聚合酶链反应(PCR)扩增法快速测定人CYP2D6*10等位基因的类型

以人CYP2D6*10等位基因位点为研究对象,建立了一种由5条引物同时PCR扩增在单管中进行等位基因快速检测的新方法。该方法在等位基因特异性扩增法的基础上,在内引物3′端引入了一个人工错配碱基并在5′端附加一段“尾巴”作为引物的锚定部分,使扩增反应的特异性得到了提高。本实验所建立的方法可在单管中同时完成SNP3种可能等位基因类型的快速检测。实测了47份样品的CYP2D6*10等位基因的类型,并随机对其中20份样品的测定结果用RFLP法进行了验证,结果完全一致。结果表明本法简便、快速,结果准确。     

纳米孔测序技术在核酸修饰检测中的应用

DNA和RNA上广泛存在着多种化学修饰.这些核酸修饰参与基因表达的调控,影响生长发育等生理过程,并可能会引发癌症等疾病.对核酸修饰的精准识别与定位有助于理解其功能机制,帮助相关疾病的诊断与治疗.纳米孔测序是一种新兴的单分子测序技术,可以根据修饰碱基与天然碱基之间阻孔信号的差异实现核酸序列中多种修饰的同时检测,是目前检测核酸修饰最直接的方法.本文简要介绍了纳米孔测序技术的发展和原理以及识别核酸修饰的算法工具,总结了纳米孔测序技术在核酸修饰检测中的应用,并对其发展前景进行了展望.     

交河故城古车师人的线粒体DNA分析

从距今2000～2500年左右的交河故城古代人骨中提取古DNA,用4对重叠引物对线粒体基因组的调控区(363bp)进行了扩增及测序.线粒体基因组编码区的扩增片段用于限制性片段多样性分析.结果显示4个个体中具有3个DNA序列,其中来自不同墓穴的两个个体的序列相同,说明这两者间有密切的母系遗传关系.系统发育分析表明古车师的这4个个体分散分布在现代新疆维吾尔人的序列之中.从这些结果可以初步得出结论,即古车师人群并不是一个同源群体,在早期铁器时代,欧亚人群的混合就已经存在了.