用于单细胞RNA分析的循环肿瘤细胞团捕获和单细胞分离方法的质量评估

循环肿瘤细胞团（Circulating tumor cell cluster, CTC cluster）的单细胞分析对CTC cluster的生物学效应分析极其重要。为了使CTC cluster单细胞分析可以获得最有效的结果,分析前的捕获和单细胞分离的过程必须能够保持CTC cluster的完整性和细胞内部RNA的完整。本研究通过单细胞RNA测序中的逆转录方法逆转录并定量3个看家基因进行RNA质控,同时测量CTC cluster的横向直径用于评估CTC cluster的完整性,从而测定CTC cluster捕获和单细胞分离过程对CTC cluster单细胞分析结果的影响。分别采用胰酶-EDTA和非酶细胞解离溶液（Non-enzymatic cell dissociation solution, NECDS）分离CTC cluster中的单细胞,并考察了单细胞分离过程对胞内RNA的影响。考察了负向富集、正向富集和膜过滤捕获方案中不同操作流程对CTC cluster完整性和单细胞内RNA完整性的影响。结果表明,NECDS可快速分离CTC cluster中的单细胞且不会对细胞内RNA产生影响...     

Spectroscopic Interrogation of Layer-by-layer Assembled Films of Conjugated Polyelectrolytes

Layer-by-layer fluorescent conjugated polyelectrolyte films have been studied. The photoluminescence of conjugate polyelectrolytes was observed to be highly tunable during this film assembly process. Efficient photoinduced electron transfer from thus prepared highly luminescent film to a natural electron-transfer protein cytochrome c has also been observed.     

焦测序法检测禽流感病毒

以焦测序技术为检测平台,在研究禽流感病毒基因特性的基础上,建立一种检测禽流感病毒及确定其是否为高致病性禽流感病毒的序列测定法。首先,选择一段保守的M基因序列及一段包含裂解位点的HA基因序列为研究对象,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增技术初步判断其是否为禽流感病毒及病毒亚型;然后采用焦测序法检测目的片段序列;最后,对焦测序法检测序列进行分析,从基因序列上判断其是否为禽流感病毒,并进一步判断病毒的亚型以及是否为高致病性禽流感病毒。研究结果表明,当焦测序反应中三磷酸酰苷双磷酸酶(Apyrase)的浓度为1.6U/mL时,能有效抑制错误信号的产生;当Klenow的浓度为90U/mL时,可读序列长度为33个碱基。采用优化的焦测序反应体系测定了4个样本,其中1个样本被判断为H5N1亚型禽流感病毒,具有潜在的高致病性;另外3个样本为H9N2型禽流感病毒,具有低致病性。本方法具有准确、快速和实时检测等优点。     

全血直接扩增结合焦磷酸测序法测定亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性

亚甲基四氢叶酸还原酶基因677C>T和1298A>C两个位点的多态性与临床常用抗肿瘤药物甲氨喋呤及氟尿嘧啶的作用密切相关,对这两个位点多态性的检测能指导临床合理用药。为进一步缩短检测时间,降低检测成本,本研究建立了基于全血直接PCR的焦测序检测方法,采用"HpH Buffer"直接扩增全血模板,仅需1μL全血样本即可对两个位点进行高效扩增。扩增产物经碱变性法制备单链模板后进行焦磷酸测序,经过条件优化,仅需5μL扩增产物和1μL微球即可完成高灵敏的焦测序反应。为验证方法的准确性,检测了12例临床样本,均能正确检测两个位点的基因多态性。本研究为临床基因多态性检测提供了一种操作简便,耗时短,成本低,准确度高的方法,本方法可用于指导甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶的个体化用药。     

焦测序技术及其在遗传分析中的应用

焦测序技术是一种新的实时DNA测序技术。它在DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,使引物延伸聚合脱氧核糖核酸(dNTP)释放焦磷酸盐(PP i)、PP i转换三磷酸腺苷(ATP)、ATP产生荧光信号与dNTP和ATP的降解等化学反应偶联起来,检测结果准确可靠。本文综述了焦测序技术的基本原理、操作步骤和它在单核苷酸多态性(SNP)研究、微生物的分型鉴定和基因甲基化检测等遗传分析中的应用,并对焦测序技术的发展作了展望。     

热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用

新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序。实验结果表明:突变后的荧光素酶在50℃环境中仍具有活性;在43℃下10min活性保留大于80%,热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明,荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。     

焦磷酸测序中PCR引物与测序引物的设计

利用焦磷酸测序技术进行核酸序列测定时,测序信号过低或非特异性信号过高均会导致测序失败。因此,PCR引物与测序引物的设计十分重要。本研究以rs8175347为例,通过设计具有不同多聚酶亲和指数(PPI)的PCR引物,并运用焦磷酸测序测定其扩增产物,考察了PPI值对扩增效率以及测序信号的影响;以rs914232、rs671位点为例,对比不同测序方向以及dNTP的推注顺序,考察了两者对测序结果的影响。结果表明,提高PCR引物的PPI值有助于增强扩增效率与测序结果的信号峰强度,测序方向和dNTP推注顺序的不合理选择会严重干扰部分SNP测序结果的判断。因此,在设计PCR引物时,应将多聚酶亲和指数理论与传统基于解链温度值的引物设计思路相结合,为焦磷酸测序提供高质量的测序模板;在进行定量测序时,还要综合考虑待测位点(SNP)两侧的序列,选择合适的测序方向以及dNTP的推注顺序,使测序结果更加准确。     

碱基序列标记法结合焦磷酸测序测定不同来源基因表达量

建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称"SRPP").先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签,PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码,使得测序结果中的序列代表基因的来源,峰高代表基因在不同来源中的相对表达量.用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证,结果表明,SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量,并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异.     

高灵敏度焦磷酸测序法定量测定基因组DNA拷贝数的变化

唐氏综合征(DOWN'S syndrome DS)又称先天愚型,21-三体综合征,是人类最常见的染色体异常引起的疾病之一.新生儿发生率为1/800～1/600,一般随着产妇年龄的增大,胎儿患有DS的风险就会提高.针对本病,目前没有有效的治疗方法,因此唯一有效可行的措施是产前筛查,早期发现,早期诊断,及时终止妊娠,避免DS患儿的出生.