含吡唑酮基团的喹唑啉衍生物的合成及其作为EGFR/VEGFR-2双靶标酪氨酸激酶抑制剂

双靶标酪氨酸激酶抑制剂在克服药物抗性和减少药物毒副作用方面具有重要作用,本文设计并合成了含有吡唑酮基团的喹唑啉衍生物作为EGFR/VEGFR-2双靶标酪氨酸激酶抑制剂。目标化合物由喹唑啉中间体和吡唑酮中间体通过亲核取代反应合成。喹唑啉中间体以2,3,4-三羟基苯甲酸为原料,通过酯化、硝化、还原、氯化和环化等反应合成;吡唑酮中间体以4-取代苯基肼盐酸盐为原料,通过甲基化和氧化等反应合成。目标化合物通过¹H NMR、¹³C NMR和HR-MS进行结构鉴定。分别采用ADP-Glo激酶活性检测方法和CCK-8法测定了目标化合物对EGFR和VEGFR-2的抑制活性以及对Hela细胞、A549细胞、HUVEC细胞的抗增殖活性,其对EGFR和VEGFR-2抑制活性IC₅₀值为10～899 nM, 15～712 nM;对部分在分子水平测定表现出较高活性的化合物进行了抗增殖活性测定,所选定的化合物对人肺癌A549细胞的半抑制浓度IC₅₀值为10～267 nM,对人脐静脉内皮细胞HUVEC的半抑制浓度IC_50...     

3-[(4'-吗啉基)-羰基或乙氧羰基]-4-苯氨基喹啉化合物的合成及抗肿瘤活性

以间氯苯胺与乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(EMME)为原料, 经缩合、 高温环合、 水解、 氯代和亲核取代等反应设计并合成了16个3位为(4'-吗啉)-羰基或乙氧羰基的4-苯氨基喹啉化合物(Ⅰ₁~Ⅰ₁₀, Ⅱ₁~Ⅱ₆). 目标化合物结构经MS及¹H NMR确证. 以MTT法, 采用表皮生长因子受体(EGFRs)高表达的人癌细胞(HeLa, HepG2, BGC-823)对目标化合物进行活性测试, 结果表明, 该类化合物对HeLa, HepG2和BGC-823细胞增殖具有一定程度的抑制作用. 其中化合物Ⅱ₄~Ⅱ₆ 对 HepG2 细胞抑制作用较强, 化合物Ⅱ₁和Ⅱ₅对BGC-823细胞抑制作用较强. 初步探讨了化合物结构与生物活性的关系.     

葡萄糖激酶M197V突变的活化机理研究

葡萄糖激酶(glucokinase, GK)催化葡萄糖转变为6-磷酸葡萄糖, 是糖代谢的第一步, 所以GK活性异常在糖代谢紊乱的发生发展中起着重要作用. 对青年型早发糖尿病(maturity-onset diabetes of the young 2, MODY 2)型和高胰岛素性低血糖症(persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy, PHHI)型的深入研究证实了GK活性改变与糖尿病的发生有关. 为了研究GK活性改变的机理, 通过分子动力学模拟和隐性溶剂的自由能的计算对GK的单点突变M197V (Met¹⁹⁷ →Val)进行了理论研究. 通过GK的C^α原子均方根浮动变化(Root mean square fluctuation, RMSF)和动态相关性矩阵(Dynamic cross-correlation matrices, DCCM)分析, 显示M197V突变导致GK在活化状态的构象更加稳定. 通过包结自由能分析, 表明M197V突变可以增加GK对葡萄糖的包结亲合性, 并且理论预测突变前后的相对包结自由能差值和已有的实验结果非常吻合. 研究结果很好地从原子水平解释了GK的M197V突变的活化机理.     

计算机辅助筛选酪氨酸激酶相关蛋白TRP-2 CTL模拟表位

运用多项式方案、量化基序方案等经典的CTL表位筛选方案, 初步筛选了酪氨酸激酶相关蛋白TRP-2 CTL表位TRP-2_180～188 (SVYDFFVWL)的模拟表位, 以通过表位改造提高其与HLA-A2.1分子结合的能力, 从而提高其免疫原性. 根据打分结果, 合成了4个得分较高的九肽序列, 亲和力实验结果表明所筛选的4个序列较原序列均有较高的亲和力, 但对2位的单突变结果较1和2位双突变结果理想, 进一步运用分子模拟方法对4个序列与HLA-A2.1分子间的相互作用进行了分子模拟分析, 分子模拟结果较好地解释了上述实验现象, 从而为进一步的结构改造提供了理论依据. 本研究提供了一个合理高效的模拟表位筛选方法.     

纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备

纳豆激酶是一种源于日本传统食品纳豆且具有强烈溶栓作用的丝氨酸蛋白酶．本研究将编码信号肽、前导肽和成熟肽在内的纳豆激酶基因克隆到原核表达载体pET28a^＋中,获得重组表达质粒pETNK．将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达．SDS-PAGE结果显示纳豆激酶在大肠杆菌中成功表达,表达的纳豆激酶融合蛋白分子量大约为31kD．亲和层析法纯化表达产物,并以此纯化产物作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔抗纳豆激酶血清,用ELISA和Western blotting对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定．纤维蛋白平板实验显示,表达的纳豆激酶融合蛋白具有较好的溶纤活性．